Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matokeo bora, tunapendekeza utumie toleo jipya la kivinjari chako (au zima Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mtindo au JavaScript.
Ugunduzi na matumizi yenye manufaa ya bidhaa asilia yanaweza kusaidia kuboresha maisha ya binadamu. Kemikali zinazozuia ukuaji wa mimea hutumika sana kama dawa za kuulia magugu ili kudhibiti magugu. Kutokana na hitaji la kutumia aina tofauti za dawa za kuulia magugu, kuna haja ya kutambua misombo yenye utaratibu mpya wa utendaji. Katika utafiti huu, tuligundua kiwanja kipya cha N-alkoxypyrrole, coumamonamide, kutoka Streptomyces werraensis MK493-CF1 na kuanzisha mchakato kamili wa usanisi. Kupitia majaribio ya shughuli za kibiolojia, tuligundua kuwa asidi ya urs-monoamic ni kiungo cha usanisi cha urs-monoamide na uwezokizuizi cha ukuaji wa mimeaZaidi ya hayo, tumetengeneza derivatives mbalimbali za asidi ya urbenoniki, ikiwa ni pamoja na derivative ya urbenyloxy (UDA), ambayo ina shughuli nyingi za kuua mimea bila kuathiri vibaya ukuaji wa seli za HeLa. Pia tuligundua kuwa derivatives za asidi ya urmotoniki huvuruga microtubules za mimea; zaidi ya hayo, KAND huathiri nyuzi za actin na kusababisha kifo cha seli; Athari hizi nyingi hutofautiana na zile za vizuizi vya microtubule vinavyojulikana na zinaonyesha utaratibu mpya wa utendaji wa asidi ya ursoni, ambayo inawakilisha faida muhimu katika ukuzaji wa dawa mpya za kuua magugu.
Ugunduzi na matumizi ya vitendo ya bidhaa asilia zenye manufaa na derivatives zake ni njia ya kuboresha ubora wa maisha ya binadamu. Metaboliti za sekondari zinazozalishwa na vijidudu, mimea na wadudu zimesababisha maendeleo makubwa katika dawa na kilimo. Dawa nyingi za viuavijasumu na za kupambana na leukemia zimetengenezwa kutoka kwa bidhaa asilia. Zaidi ya hayo, aina mbalimbali zadawa za kuulia wadudu, dawa za kuua magugu na dawa za kuulia magugu hutolewa kutoka kwa bidhaa hizi asilia kwa ajili ya matumizi katika kilimo. Hasa, dawa za kuulia magugu za kudhibiti magugu ni zana muhimu za kuongeza mavuno ya mazao katika kilimo cha kisasa, na aina mbalimbali za misombo tayari zinatumika kibiashara. Michakato kadhaa ya seli katika mimea, kama vile usanisinuru, umetaboli wa amino asidi, usanisi wa ukuta wa seli, udhibiti wa mitosisi, ishara ya phytohomoni, au usanisi wa protini, huchukuliwa kuwa shabaha za kawaida za dawa za kuulia magugu. Misombo inayozuia utendaji kazi wa tubule ndogo ni kundi la kawaida la dawa za kuulia magugu zinazoathiri ukuaji wa mimea kwa kuathiri udhibiti wa mitosisi2.
Microtubules ni vipengele vya saitoskeletoni na huhifadhiwa sana katika seli za yukariyoti. Heterodimer ya tubulin ina α-tubulin na β-tubulin zinazounda protofilamenti za microtubule zenye mstari, huku protofilamenti 13 zikiunda muundo wa silinda. Microtubules huchukua majukumu mengi katika seli za mimea, ikiwa ni pamoja na kuamua umbo la seli, mgawanyiko wa seli, na usafirishaji wa ndani ya seli3,4. Seli za mimea zina microtubules chini ya utando wa plasma wa awamu ya kati, na hizi zinazoitwa microtubules za gamba zinadhaniwa kudhibiti mpangilio wa microfibrils za selulosi kupitia udhibiti wa michanganyiko ya synthase ya selulosi4,5. Microtubules za gamba za seli za mizizi ya epidermal, zilizopo katika eneo la upanuzi wa haraka wa ncha ya mizizi, ziko pembeni, na microfibers za selulosi hufuata microtubules hizi na kupunguza mwelekeo wa upanuzi wa seli, na hivyo kukuza upanuzi wa seli za anisotropic. Kwa hivyo, kazi ya microtubule inahusiana kwa karibu na mofolojia ya mmea. Uingizwaji wa asidi amino katika jeni zinazosimba tubulini husababisha mgeuko wa safu za gamba la gamba na ukuaji wa upande wa kushoto au kulia katika Arabidopsis 6,7. Vile vile, mabadiliko katika protini zinazohusiana na tubulini zinazodhibiti mienendo ya tubulini yanaweza pia kusababisha ukuaji wa mizizi uliopotoka8,9,10,11,12,13. Zaidi ya hayo, matibabu ya dawa za kuulia wadudu zinazoharibu tubulini kama vile disopyramide, pia inajulikana kama pretilachlor, pia husababisha ukuaji wa mizizi ya oblique ya upande wa kushoto14. Data hizi zinaonyesha kuwa udhibiti sahihi wa utendaji kazi wa tubulini ni muhimu kwa kubaini mwelekeo wa ukuaji wa mmea.
Aina mbalimbali za vizuizi vya microtubule zimegunduliwa, na dawa hizi zimetoa mchango mkubwa katika utafiti wa saitoskeletal, pamoja na kilimo na dawa2. Hasa, oryzalin, misombo ya dinitroaniline, disopyramide, misombo inayohusiana na benzamide, na analogi zake zinaweza kuzuia utendaji kazi wa microtubule na hivyo kuzuia ukuaji wa mimea. Kwa hivyo, hutumika sana kama dawa za kuulia magugu. Hata hivyo, kwa kuwa microtubule ni sehemu muhimu ya seli za mimea na wanyama, vizuizi vingi vya microtubule ni sumu kwa aina zote mbili za seli. Kwa hivyo, licha ya matumizi yake yanayotambuliwa kama dawa za kuulia magugu, idadi ndogo ya mawakala wa antimicrotubule hutumiwa kwa madhumuni ya vitendo.
Streptomyces ni jenasi ya familia ya Streptomyces, ambayo inajumuisha bakteria ya aerobic, gram-chanya, filamentous na inajulikana sana kwa uwezo wake wa kutoa aina mbalimbali za metabolites za sekondari. Kwa hivyo, inachukuliwa kuwa moja ya vyanzo muhimu zaidi vya bidhaa mpya za asili zinazofanya kazi kibiolojia. Katika utafiti wa sasa, tuligundua kiwanja kipya kinachoitwa coumamonamide, ambacho kilitengwa kutoka Streptomyces werraensis MK493-CF1 na S. werraensis ISP 5486. Kwa kutumia uchambuzi wa spektrali na uchambuzi kamili wa spektrali, muundo wa coumamonamide ulibainishwa na usanisi wake wa kipekee wa mifupa ya N-alkoxypyrrole ulibainishwa. Asidi ya Ursmonic, kiungo cha kati cha ursmonoamide na derivatives zake, iligunduliwa kuzuia ukuaji na kuota kwa mmea maarufu wa mfano Arabidopsis thaliana. Katika utafiti wa uhusiano wa muundo-shughuli, tuligundua kuwa kiwanja chenye C9 kilichobadilishwa kuwa asidi ya ursonic, kinachoitwa nonyloxy derivative ya asidi ya ursonic (KAND), huongeza kwa kiasi kikubwa athari ya kuzuia ukuaji na kuota. Ikumbukwe kwamba kizuizi kipya cha ukuaji wa mimea kilichogunduliwa pia kiliathiri ukuaji wa tumbaku na liverwort na hakikuwa na sumu kwa bakteria au seli za HeLa. Zaidi ya hayo, baadhi ya derivatives za asidi ya urmotonic husababisha aina ya mizizi iliyopotoka, ikimaanisha kwamba derivatives hizi huathiri microtubules moja kwa moja au kwa njia isiyo ya moja kwa moja. Sambamba na wazo hili, uchunguzi wetu wa microtubules zilizoandikwa ama immunohistochemically au kwa protini za fluorescent zinaonyesha kwamba matibabu ya KAND huondoa polima microtubules. Zaidi ya hayo, matibabu na derivatives za asidi ya kumamotonic yalivuruga microfilaments za actin. Hivyo, tumegundua kizuizi kipya cha ukuaji wa mimea ambacho utaratibu wake wa kipekee wa utendaji unahusisha uharibifu wa cytoskeleton.
Mchuzi MK493-CF1 ulitengwa kutoka kwenye udongo huko Shinagawa-ku, Tokyo. Mchuzi MK493-CF1 uliunda mycelium ya stromal yenye matawi mazuri. Mfuatano wa sehemu wa jeni la RNA la ribosomal la 16S (1422 bp) ulibainishwa. Mchuzi huu unafanana sana na S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: mchuzi wa kawaida, 99.93%). Kulingana na matokeo haya, ilibainika kuwa mchuzi huu ulikuwa na uhusiano wa karibu na mchuzi wa aina ya S. werraensis. Kwa hivyo, tuliuita kwa muda mchuzi huu S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T pia hutoa misombo sawa ya kibiolojia. Kwa kuwa kulikuwa na utafiti mdogo wa mapema kuhusu kupata bidhaa asilia kutoka kwa vijidudu hivi, utafiti zaidi wa kemikali ulifanywa. Baada ya kulima S. werraensis MK493-CF1 kwenye shayiri kwa kuchachusha hali ngumu kwa 30°C kwa siku 14, sampuli hiyo ilitolewa kwa 50% EtOH. 60 ml ya sampuli ilikaushwa ili kupata 59.5 mg ya dondoo ghafi. Dondoo ghafi ilifanyiwa HPLC ya awamu ya nyuma ili kutoa N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, inayoitwa coumamonamide, 36.0 mg). Jumla ya 1 ni takriban 60% ya dondoo ghafi. Kwa hivyo, tuliamua kusoma kwa undani sifa za kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 ni unga mweupe usio na umbo na spektrometri ya wingi yenye ubora wa juu (HRESIMS) inathibitisha C6H8N2O2 (Mchoro 1). Kipande cha pyrrole kilichobadilishwa na C2 cha kiwanja hiki kina sifa ya δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH katika wigo wa 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) na δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), na wigo wa 13C NMR unaonyesha uwepo wa atomi nne za kaboni sp2. Uwepo wa kikundi cha amide katika nafasi ya C2 ulipimwa kwa uwiano wa HMBC kutoka protoni ya C-3 hadi kaboni ya amide kabonili katika δC 161.1. Kwa kuongezea, kilele cha 1 H na 13 C NMR katika δH 4.10 (3H, S) na δC 68.3 zinaonyesha uwepo wa vikundi vya N-methoxy katika molekuli. Ingawa nafasi sahihi ya kikundi cha methoxy haikuwa imeamuliwa kwa kutumia uchanganuzi wa spectroskopu kama vile spektroskopia ya tofauti iliyoimarishwa na kifupisho cha nyuklia cha Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ikawa kiwanja cha kwanza kinachopendekezwa.
Ili kubaini muundo sahihi wa 1, usanisi kamili ulifanywa (Mchoro 2a). Matibabu ya 2-aminopyridine 2 inayopatikana kibiashara na m-CPBA yalisababisha N-oksidi 3 inayolingana katika mavuno ya kiasi. Baada ya 2-aminoazidation ya 2, mmenyuko wa cyclocondensation ulioelezewa na Abramovich ulifanyika katika benzeni kwa 90°C ili kupata 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 katika gramu. Kasi 60% (hatua mbili). 15,16. Methylation na hidrolisisi ya 4 kisha ilitoa 1-methoxy-1H-pyrrole-2-kaboksiliki asidi (inayoitwa "asidi ya cumotonic", 6) katika mavuno mazuri (70%, hatua mbili). Hatimaye, amidation kupitia asidi kloridi ya kati 6 kwa kutumia amonia ya maji ilimpa Kumamoto amide 1 katika mavuno ya 98%. Data yote ya spektrali ya 1 iliyosanisiwa ilikuwa sawa na 1 iliyotengwa, kwa hivyo muundo wa 1 ulibainishwa;
Usanisi wa jumla na uchambuzi wa shughuli za kibiolojia za urbenamide na asidi ya urbeniki. (a) Usanisi kamili wa amide ya Kumamoto. (b) Miche ya Arabidopsis Columbia (Col) ya aina ya mwitu ya siku saba ilipandwa kwenye sahani za Murashige na Skoog (MS) zenye coumamonamide 6 au coumamonamide 1 kwa viwango vilivyoonyeshwa. Upau wa kipimo = 1 cm.
Kwanza, tulitathmini shughuli za kibiolojia za urbenamide na viungo vyake vya kati kwa uwezo wao wa kurekebisha ukuaji wa mimea. Tuliongeza viwango mbalimbali vya ursmonamide 1 au asidi ya ursmonic 6 kwenye MS agar medium na miche ya Arabidopsis thaliana iliyokuzwa kwenye chombo hiki. Majaribio haya yalionyesha kuwa viwango vya juu (500 μM) vya 6 vilizuia ukuaji wa mizizi (Mchoro 2b). Kisha, tulizalisha derivatives mbalimbali kwa kubadilisha nafasi ya N1 ya 6 na kufanya tafiti za uhusiano wa muundo-shughuli juu yake (mchakato wa usanisi wa analogi umeelezewa katika Taarifa Saidizi (SI)). Miche ya Arabidopsis ilipandwa kwenye chombo kilicho na derivatives ya asidi ya ursonic ya 50 μM, na urefu wa mizizi ulipimwa. kama inavyoonyeshwa kwenye picha. Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 3a, b, na S1, asidi za coumamo zina urefu tofauti wa minyororo ya alkoksi ya mstari (9, 10, 11, 12, na 13) au minyororo mikubwa ya alkoksi (15, 16, na 17) katika nafasi ya N1. Viambato hivyo vilionyesha kizuizi kikubwa cha ukuaji wa mizizi. Zaidi ya hayo, tuligundua kuwa matumizi ya 200 μM 10, 11, au 17 yalizuia kuota (Michoro 3c na S2).
Utafiti wa uhusiano wa muundo-shughuli wa amide ya Kumamoto na misombo inayohusiana. (a) Mpango wa muundo na usanisi wa analojia. (b) Upimaji wa urefu wa mizizi ya miche ya siku 7 iliyopandwa kwenye njia ya kati ya MS ikiwa na au bila derivatives ya coumamonamide ya 50 μM. Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika matibabu ya bandia (t test, p).< 0.05). n>18. Data zinaonyeshwa kama wastani ± SD. nt inamaanisha "haijajaribiwa" kwa sababu zaidi ya 50% ya mbegu hazikuota. (c) Upimaji wa kiwango cha kuota cha mbegu zilizotibiwa zilizoanguliwa kwa siku 7 katika hali ya MS ikiwa na au bila coumamonamide 200 μM na misombo inayohusiana. Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika matibabu ya bandia (jaribio la mraba la chi). n=96.
Cha kufurahisha ni kwamba, kuongezwa kwa minyororo ya pembeni ya alkyl ndefu kuliko C9 kulipunguza shughuli ya kuzuia, ikidokeza kwamba misombo inayohusiana na asidi ya kumamotoki inahitaji minyororo ya pembeni ya ukubwa fulani ili kuonyesha shughuli zao za kibiolojia.
Kwa sababu uchambuzi wa uhusiano wa muundo-shughuli ulionyesha kuwa C9 ilibadilishwa kuwa asidi ya ursonic na derivative isiyo na niloksi ya asidi ya ursonic (hapa itajulikana kama KAND 11) ilikuwa kizuizi bora zaidi cha ukuaji wa mimea, tulifanya uainishaji wa kina zaidi wa KAND 11. Matibabu ya Arabidopsis kwa kutumia 50 μM KAND 11 karibu yalizuia kabisa kuota, ilhali viwango vya chini (40, 30, 20, au 10 μM) vya KAND 11 vilizuia ukuaji wa mizizi kwa njia inayotegemea kipimo (Mchoro 4a, b). Ili kujaribu kama KAND 11 inaathiri uwezo wa mizizi kustawi, tulichunguza meristems za mizizi zilizopakwa rangi ya propidium iodide (PI) na kupima ukubwa wa eneo la meristem. Ukubwa wa meristem ya miche iliyopandwa kwenye kipato chenye 25 μM KAND-11 ulikuwa 151.1 ± 32.5 μm, huku ukubwa wa meristem ya miche iliyopandwa kwenye kipato chenye DMSO ulikuwa 264.7 ± 30.8 μm (Mchoro 4c, d), ambayo inaonyesha kwamba KAND-11 hurejesha shughuli za seli. kueneza. Meristem ya mizizi. Sambamba na hili, matibabu ya KAND 11 yalipunguza kiasi cha ishara ya mgawanyiko wa seli CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS katika meristem ya mizizi (Mchoro 4e) 17. Matokeo haya yanaonyesha kwamba KAND 11 huzuia ukuaji wa mizizi kwa kupunguza shughuli za kuongezeka kwa seli.
Uchambuzi wa athari ya kizuizi cha derivatives ya asidi ya urbenoniki (derivatives ya urbenyloxy) kwenye ukuaji. (a) Miche ya aina ya mwitu ya Col yenye umri wa siku 7 iliyopandwa kwenye sahani za MS yenye viwango vilivyoonyeshwa vya KAND 11. Upau wa mizani = 1 cm. (b) Upimaji wa urefu wa mzizi. Herufi zinaonyesha tofauti kubwa (jaribio la Tukey HSD, uk.< 0.05). n>16. Data zinaonyeshwa kama wastani ± SD. (c) Hadubini ya confocal ya mizizi ya porini ya aina ya Col iliyopakwa iodidi ya propidium iliyopandwa kwenye sahani za MS zenye au bila 25 μM KAND 11. Mabano meupe yanaonyesha meristem ya mizizi. Upau wa kipimo = 100 µm. (d) Upimaji wa ukubwa wa meristem ya mizizi (n = 10 hadi 11). Tofauti za takwimu zilibainishwa kwa kutumia jaribio la t (p).< 0.05). Pau zinawakilisha ukubwa wa wastani wa meristem. (e) Hadubini ya tofauti ya utofautishaji wa mwingiliano (DIC) ya meristem ya mizizi iliyo na muundo wa CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS iliyopakwa rangi na kuchorwa kwenye miche ya siku 5 iliyopandwa kwenye sahani za MS ikiwa na au bila kipimo cha KAND cha 25 µM.
Sumu ya mimea ya KAND 11 ilijaribiwa zaidi kwa kutumia mmea mwingine wa dicotyledonous, tumbaku (Nicotiana tabacum), na kiumbe kikubwa cha mfano wa mimea ya ardhini, liverwort (Marchantia polymorpha). Kama ilivyo katika kisa cha Arabidopsis, miche ya tumbaku ya SR-1 iliyopandwa kwenye kiwango cha kati chenye 25 μM KAND 11 ilitoa mizizi mifupi (Mchoro 5a). Zaidi ya hayo, mbegu 40 kati ya 48 ziliota kwenye sahani zenye 200 μM KAND 11, ilhali mbegu zote 48 ziliota kwenye vyombo vya habari vilivyotibiwa kwa mfano, ikionyesha kuwa viwango vya juu vya KAND vilikuwa muhimu (p.< 0.05; kipimo cha chi -mraba) kilizuia kuota kwa tumbaku. (Mchoro 5b). Kwa kuongezea, mkusanyiko wa KAND 11 uliozuia ukuaji wa bakteria katika liverwort ulikuwa sawa na mkusanyiko mzuri katika Arabidopsis (Mchoro 5c). Matokeo haya yanaonyesha kuwa KAND 11 inaweza kuzuia ukuaji wa mimea mbalimbali. Kisha tukachunguza uwezekano wa sumu ya misombo inayohusiana na monoamide ya dubu katika viumbe vingine, yaani seli za HeLa za binadamu na aina ya Escherichia coli DH5α, kama wawakilishi wa seli za wanyama na bakteria za juu, mtawalia. Katika mfululizo wa majaribio ya kuenea kwa seli, tuliona kwamba coumamonamide 1, asidi ya coumamonamidic 6, na KAND 11 hazikuathiri ukuaji wa seli za HeLa au E. coli katika viwango vya 100 μM (Mchoro 5d,e).
Kizuizi cha ukuaji wa KAND 11 katika viumbe visivyo vya Arabidopsis. (a) Miche ya tumbaku ya SR-1 ya aina ya mwitu yenye umri wa wiki mbili ilipandwa kwenye sahani za MS zilizowekwa wima zenye 25 μM KAND 11. (b) Miche ya tumbaku ya SR-1 ya aina ya mwitu yenye umri wa wiki mbili ilipandwa kwenye sahani za MS zilizowekwa mlalo zenye 200 μM KAND 11. (c) Vichipukizi vya liverwort vya aina ya mwitu vya Tak-1 vilivyopandwa kwenye sahani za Gamborg B5 vyenye viwango vilivyoonyeshwa vya KAND 11. Mishale nyekundu inaonyesha spores zilizoacha kukua ndani ya kipindi cha wiki mbili cha kupevuka. (d) Kipimo cha kuongezeka kwa seli za HeLa. Idadi ya seli zinazoweza kuishi ilipimwa kwa vipindi vya muda vilivyowekwa kwa kutumia kifaa cha kuhesabu seli 8 (Dojindo). Kama udhibiti, seli za HeLa zilitibiwa na 5 μg/ml actinomycin D (Act D), ambayo huzuia unukuzi wa RNA polimerasi na kusababisha kifo cha seli. Uchambuzi ulifanywa kwa nakala tatu. (e) Kipimo cha kuongezeka kwa seli za E. coli. Ukuaji wa E. coli ulichambuliwa kwa kupima OD600. Kama udhibiti, seli zilitibiwa na ampicillin 50 μg/ml (Amp), ambayo huzuia usanisi wa ukuta wa seli za bakteria. Uchambuzi ulifanywa kwa nakala tatu.
Ili kubaini utaratibu wa utendaji wa sumu ya seli inayosababishwa na misombo inayohusiana na uramide, tulichambua upya derivatives za asidi ya urbeniki kwa athari za wastani za kuzuia. Kama inavyoonyeshwa kwenye picha. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 2b, 6a, miche iliyopandwa kwenye sahani za agar zenye viwango vya juu (200 μM) vya asidi ya urmotonic 6 ilitoa mizizi mifupi na iliyopinda kushoto (θ = – 23.7 ± 6.1), ilhali ya miche iliyopandwa kwenye njia ya udhibiti, miche ilitoa mizizi iliyonyooka karibu (θ = – 3.8 ± 7.1). Ukuaji huu wa tabia wa oblique unajulikana kutokana na kutofanya kazi vizuri kwa microtubules za gamba14,18. Sambamba na ugunduzi huu, dawa za kupunguza utulivu wa microtubule disopyramide na oryzalin zilisababisha kuinama kwa mizizi sawa chini ya hali zetu za ukuaji (Michoro 2b, 6a). Wakati huo huo, tulijaribu derivatives za asidi ya urmotonic na tukachagua kadhaa kati yao ambazo, kwa viwango fulani, zilisababisha ukuaji wa mizizi oblique. Misombo 8, 9, na 15 ilibadilisha mwelekeo wa ukuaji wa mizizi katika 75 μM, 50 μM, na 40 μM, mtawalia, ikionyesha kwamba misombo hii inaweza kudhoofisha uthabiti wa microtubules kwa ufanisi (Mchoro 2b, 6a). Pia tulijaribu derivative ya asidi ya ursolic yenye nguvu zaidi, KAND 11, kwa kiwango cha chini (15 µM) na kugundua kuwa matumizi ya KAND 11 yalizuia ukuaji wa mizizi na kwamba mwelekeo wa ukuaji wa mizizi haukuwa sawa, ingawa yalikuwa yanaelekea kuteleza upande wa kushoto (Mchoro C3). Kwa sababu viwango vya juu vya dawa za kudhoofisha microtubules wakati mwingine huzuia ukuaji wa mimea badala ya kusababisha kuinamisha mizizi, baadaye tulitathmini uwezekano kwamba KAND 11 huathiri microtubules kwa kuchunguza microtubules za gamba katika seli za epidermal za mizizi. Immunohistochemistry kwa kutumia kingamwili za anti-β-tubulin katika seli za epidermal za mizizi ya miche iliyotibiwa na 25 μM KAND 11 ilionyesha kutoweka kwa karibu microtubules zote za gamba katika seli za epidermal katika eneo la kurefusha (Mchoro 6b). Matokeo haya yanaonyesha kwamba asidi ya kumamotonic na derivatives zake hufanya kazi moja kwa moja au kwa njia isiyo ya moja kwa moja kwenye mikrotubuli ili kuzivuruga na kwamba misombo hii ni vizuizi vipya vya mikrotubuli.
Asidi ya Ursonic na derivatives zake hubadilisha microtubules za gamba katika Arabidopsis thaliana. (a) Pembe ya mwelekeo wa mizizi iliyopimwa mbele ya derivatives mbalimbali za asidi ya urmotonic katika viwango vilivyoonyeshwa. Athari za misombo miwili inayojulikana kuzuia microtubules: disopyramide na oryzalin pia zilichambuliwa. Picha iliyo ndani inaonyesha kiwango kinachotumika kupima pembe ya ukuaji wa mizizi. Nyota zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya uwongo (t test, p< 0.05). n>19. Upau wa kipimo = 1 cm. (b) Mikrotubuli za kortikali katika seli za epidermal katika eneo la kurefusha. Mikrotubuli katika mizizi ya Arabidopsis ya aina ya mwituni iliyokua kwenye sahani za MS ikiwa na au bila 25 μM KAND 11 ilionyeshwa kwa kuchorea kwa kingamwili kwa kutumia kingamwili za msingi za β-tubulin na kingamwili za sekondari zilizounganishwa na Alexa Fluor. Upau wa kipimo = 10 µm. (c) Muundo wa mikrotubuli kwenye mzizi wa meristem. Mikrotubuli zilionyeshwa kwa kutumia kuchorea kwa kingamwili. Miundo ya mikrotubuli, ikiwa ni pamoja na maeneo ya prophase, spindles, na phragmoplasts, ilihesabiwa kutoka kwa picha za confocal. Mishale inaonyesha miundo ya mikrotubuli ya mikrotubuli. Nyota zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya uwongo (t test, p< 0.05). n>9. Upau wa kipimo = 50 µm.
Ingawa Ursa ina uwezo wa kuvuruga utendaji kazi wa microtubule, utaratibu wake wa utendaji unatarajiwa kuwa tofauti na mawakala wa kawaida wa microtubule depolimerizing. Kwa mfano, viwango vya juu vya mawakala wa microtubule depolimerizing kama vile disopyramide na oryzalin husababisha upanuzi wa anisotropic wa seli za epidermal, ilhali KAND 11 haifanyi hivyo. Zaidi ya hayo, matumizi ya pamoja ya KAND 11 na disopyramide yalisababisha mwitikio wa ukuaji wa mizizi unaosababishwa na disopyramide na kizuizi cha ukuaji kinachosababishwa na KAND 11 kilionekana (Mchoro S4). Pia tulichambua mwitikio wa mutant nyeti sana ya disopyramide 1-1 (phs1-1) kwa KAND 11. phs1-1 ina mabadiliko yasiyo ya kisheria ya nukta ya tubulin kinase na hutoa mizizi mifupi inapotibiwa na disopyramide9,20. Miche ya mutant ya phs1-1 iliyopandwa kwenye agar medium yenye KAND 11 ilikuwa na mizizi mifupi sawa na ile iliyopandwa kwenye disopyramid (mchoro S5).
Zaidi ya hayo, tuliona miundo ya mitoti ndogo, kama vile maeneo ya prophase, spindles, na phragmoplasts, katika mizizi ya miche iliyotibiwa na KAND 11. Sambamba na uchunguzi wa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, kupungua kwa kiasi kikubwa kwa idadi ya mitoti ndogo kulionekana (Mchoro .6c).
Ili kubainisha sumu ya KAND 11 katika ubora wa seli ndogo, tulitibu seli za tumbaku za BY-2 kwa kutumia KAND 11 na kuchunguza mwitikio wao. Kwanza tuliongeza KAND 11 kwa seli za BY-2 zinazoonyesha TagRFP-TUA6, ambayo huweka lebo kwenye microtubules kwa mwangaza, ili kutathmini athari ya KAND 11 kwenye microtubules za gamba. Msongamano wa microtubules za gamba ulipimwa kwa kutumia uchanganuzi wa picha, ambao ulipima asilimia ya pikseli za saitoskeletal miongoni mwa pikseli za saitoplazimu. Matokeo ya jaribio yalionyesha kuwa baada ya matibabu na 50 μM au 100 μM KAND 11 kwa saa 1, msongamano ulipungua kwa kiasi kikubwa hadi 0.94 ± 0.74% au 0.23 ± 0.28%, mtawalia, huku msongamano wa seli zilizotibiwa na DMSO, ukifikia 1.61 ± 0.34% (Mchoro 7a). Matokeo haya yanaendana na uchunguzi katika Arabidopsis kwamba matibabu ya KAND 11 husababisha depolimeri ya microtubules za gamba (Mchoro 6b). Pia tulichunguza mstari wa BY-2 na nyuzi za actin zenye lebo ya GFP-ABD baada ya matibabu kwa mkusanyiko sawa wa KAND 11 na tukagundua kuwa matibabu ya KAND 11 yalivuruga nyuzi za actin. Matibabu na 50 μM au 100 μM KAND 11 kwa saa 1 yalipunguza kwa kiasi kikubwa msongamano wa nyuzi za actin hadi 1.20 ± 0.62% au 0.61 ± 0.26%, mtawalia, ilhali msongamano katika seli zilizotibiwa na DMSO ulikuwa 1.69 ± 0.51% (Mchoro 2). 7b). Matokeo haya yanapingana na athari za propyzamide, ambayo haiathiri nyuzi za actin, na latrunculin B, depolimerizer ya actin ambayo haiathiri microtubules (Mchoro wa SI S6). Kwa kuongezea, matibabu na coumamonamide 1, asidi ya coumamonamide 6, au KAND 11 hayakuathiri mikrotubuli katika seli za HeLa (Kielelezo cha SI S7). Kwa hivyo, utaratibu wa utendaji wa KAND 11 unaaminika kuwa tofauti na ule wa visumbufu vya saitoskeletoni vinavyojulikana. Kwa kuongezea, uchunguzi wetu wa hadubini wa seli za BY-2 zilizotibiwa na KAND 11 ulionyesha mwanzo wa kifo cha seli wakati wa matibabu ya KAND 11 na ulionyesha kuwa idadi ya seli zilizokufa zenye rangi ya bluu ya Evans haikuongezeka sana baada ya dakika 30 za matibabu ya KAND 11, ilhali baada ya dakika 90 za matibabu na 50 μM au 100 μM KAND, idadi ya seli zilizokufa iliongezeka hadi 43.7% au 80.1%, mtawalia (Kielelezo 7c). Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha kuwa KAND 11 mpya inayotokana na asidi ya ursolic ni kizuizi kipya cha saitoskeletal maalum cha mmea chenye utaratibu wa utendaji ambao haukujulikana hapo awali.
KAND huathiri mikrotubuli za gamba, nyuzi za aktini, na uwezo wa seli za BY-2 za tumbaku. (a) Taswira ya mikrotubuli za gamba katika seli za BY-2 mbele ya TagRFP-TUA6. Seli za BY-2 zilizotibiwa na KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini ya confocal. Uzito wa mikrotubuli za gamba ulihesabiwa kutoka kwa mikrografu za seli 25 huru. Herufi zinaonyesha tofauti kubwa (jaribio la Tukey HSD, uk.< 0.05). Upau wa kipimo = 10 µm. (b) Filamenti za aktini ya kortikali katika seli za BY-2 zilizoonekana mbele ya GFP-ABD2. Seli za BY-2 zilizotibiwa na KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini ya confocal. Uzito wa filamenti za aktini ya kortikali ulihesabiwa kutoka kwa mikrografu za seli 25 huru. Herufi zinaonyesha tofauti kubwa (jaribio la Tukey HSD, uk.< 0.05). Upau wa kipimo = 10 µm. (c) Uchunguzi wa seli zilizokufa za BY-2 kwa kutumia rangi ya bluu ya Evans. Seli za BY-2 zilizotibiwa kwa KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini ya uwanja mkali. n=3. Upau wa kipimo = 100 µm.
Ugunduzi na matumizi ya bidhaa mpya za asili umesababisha maendeleo makubwa katika nyanja mbalimbali za maisha ya binadamu, ikiwa ni pamoja na dawa na kilimo. Utafiti wa kihistoria umefanywa ili kupata misombo muhimu kutoka kwa rasilimali asilia. Hasa, actinomycetes zinajulikana kuwa muhimu kama viuavijasumu vya kuzuia vimelea kwa minyoo kutokana na uwezo wao wa kutoa metaboliti mbalimbali za sekondari kama vile avermectin, kiwanja kinachoongoza cha ivermectin na bleomycin na derivatives zake, zinazotumika kimatibabu kama wakala wa kupambana na saratani21,22. Vile vile, aina mbalimbali za misombo ya kuua mimea zimegunduliwa kutoka kwa actinomycetes, ambazo baadhi yake tayari zinatumika kibiashara1,23. Kwa hivyo, uchambuzi wa metaboliti za actinomycete ili kutenganisha bidhaa asilia zenye shughuli zinazohitajika za kibiolojia unachukuliwa kuwa mkakati mzuri. Katika utafiti huu, tuligundua kiwanja kipya, coumamonamide, kutoka S. werraensis na tukakitengeneza kwa mafanikio. Asidi ya Ursonic ni kiambatisho cha urbenamide na derivatives zake. Inaweza kusababisha mkunjo wa mizizi, kuonyesha shughuli ya wastani hadi kali ya kuua mimea, na kuharibu microtubules za mimea moja kwa moja au kwa njia isiyo ya moja kwa moja. Hata hivyo, utaratibu wa utendaji wa asidi ya urmotonic unaweza kutofautiana na ule wa vizuizi vilivyopo vya microtubule, kwani KAND 11 pia huvuruga nyuzi za actini na kusababisha kifo cha seli, ikidokeza utaratibu wa udhibiti ambao asidi ya urmotonic na derivatives zake huathiri miundo mbalimbali ya saitoskeletal.
Ufafanuzi zaidi wa kina wa asidi ya urbenoniki utasaidia kuelewa vyema utaratibu wa utendaji wa asidi ya urbenoniki. Hasa, lengo linalofuata ni kutathmini uwezo wa asidi ya ursoniki kufungamana na microtubules zilizopunguzwa ili kubaini kama asidi ya ursoniki na derivatives zake hufanya kazi moja kwa moja kwenye microtubules na kuziondoa polima, au kama hatua yao husababisha uundaji wa microtubules. Zaidi ya hayo, katika hali ambapo microtubules si shabaha ya moja kwa moja, kutambua eneo la utendaji na malengo ya molekuli ya asidi ya ursoniki kwenye seli za mimea kutasaidia kuelewa zaidi sifa za misombo inayohusiana na njia zinazowezekana za kuboresha shughuli za kuua mimea. Jaribio letu la shughuli za kibiolojia lilifunua uwezo wa kipekee wa sumu ya asidi ya ursoniki kwenye ukuaji wa mimea kama vile Arabidopsis thaliana, tumbaku na liverwort, huku seli za E. coli wala HeLa zisipoathiriwa. Sumu kidogo au hakuna kabisa kwa seli za wanyama ni faida ya derivatives ya asidi ya ursoniki ikiwa itatengenezwa kama dawa za kuulia wadudu kwa matumizi katika mashamba ya wazi ya kilimo. Hakika, kwa kuwa microtubules ni miundo ya kawaida katika yukariyoti, kizuizi chao cha kuchagua katika mimea ni hitaji muhimu la dawa za kuulia wadudu. Kwa mfano, propyzamide, wakala wa kuondoa upolimeri wa microtubule ambao hufunga moja kwa moja kwenye tubulin na kuzuia upolimishaji, hutumika kama dawa ya kuua magugu kutokana na sumu yake ndogo kwa seli za wanyama. Tofauti na disopyramide, benzamidi zinazohusiana zina sifa maalum tofauti. Mbali na microtubules za mimea, RH-4032 au benzoxamide pia huzuia microtubules za seli za wanyama au oomycetes, mtawalia, na zalilamide hutumika kama dawa ya kuua fungi kutokana na sumu yake ndogo ya phyto25,26,27. Dubu aliyegunduliwa hivi karibuni na derivatives zake huonyesha sumu maalum dhidi ya mimea, lakini ni muhimu kuzingatia kwamba marekebisho zaidi yanaweza kubadilisha sifa maalum za lengwa, na uwezekano wa kutoa derivatives za ziada kwa ajili ya kudhibiti fangasi au oomycetes zinazosababisha magonjwa.
Sifa za kipekee za asidi ya urbenoniki na derivatives zake ni muhimu kwa ukuaji wake kama dawa za kuulia magugu na matumizi kama zana za utafiti. Umuhimu wa saitoskeletoni katika kudhibiti umbo la seli ya mimea unatambuliwa sana. Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa mimea imeunda mifumo tata ya mpangilio wa microtubule ya gamba kwa kudhibiti mienendo ya microtubule ili kudhibiti umbo la mofogenesis ipasavyo. Idadi kubwa ya molekuli zinazohusika na udhibiti wa shughuli za microtubule zimetambuliwa, na utafiti unaohusiana bado unaendelea3,4,28. Uelewa wetu wa sasa wa mienendo ya microtubule katika seli za mimea hauelezi kikamilifu mifumo ya mpangilio wa microtubule ya gamba. Kwa mfano, ingawa disopyramide na oryzalin zote zinaweza kuondoa polima ya microtubule, disopyramide husababisha upotoshaji mkubwa wa mizizi huku oryzalin ikiwa na athari ndogo. Zaidi ya hayo, mabadiliko katika tubulin, ambayo hutuliza microtubule, pia husababisha dextrorotation katika mizizi, ilhali paclitaxel, ambayo pia hutuliza mienendo ya microtubule, haifanyi hivyo. Kwa hivyo, kusoma na kutambua malengo ya molekuli ya asidi ya ursolic kunapaswa kutoa ufahamu mpya kuhusu udhibiti wa microtubule za gamba za mimea. Vile vile, ulinganisho wa baadaye wa kemikali ambazo zinafaa katika kukuza ukuaji uliopotoka, kama vile disopyramide, na kemikali zisizo na ufanisi, kama vile oryzalin au asidi ya kumamotoric, utatoa vidokezo vya jinsi ukuaji uliopotoka unavyotokea.
Kwa upande mwingine, upangaji upya wa saitoskeletal unaohusiana na ulinzi ni uwezekano mwingine wa kuelezea sumu ya saitoskeletal ya asidi ya ursonic. Maambukizi ya pathojeni au kuingizwa kwa ecitor kwenye seli za mimea wakati mwingine husababisha uharibifu wa saitoskeleton na kifo cha seli kinachofuata29. Kwa mfano, cryptoxanthin inayotokana na oomycete imeripotiwa kuvuruga microtubules na filaments za actin kabla ya kifo cha seli za tumbaku, sawa na kile kinachotokea kwa matibabu ya KAND30,31. Kufanana kati ya majibu ya ulinzi na majibu ya seli yanayosababishwa na asidi ya ursonic kulitufanya tufikirie kwamba husababisha michakato ya kawaida ya seli, ingawa athari ya haraka na yenye nguvu ya asidi ya ursonic kuliko cryptoxanthin inaonekana. Hata hivyo, tafiti zimeonyesha kuwa kuvuruga kwa filaments za actin kunakuza kifo cha seli cha ghafla, ambacho sio kila wakati huambatana na kuvuruga kwa microtubule29. Kwa kuongezea, bado itaonekana ikiwa pathojeni au ecitor husababisha ukuaji wa mizizi uliopotoka, kama vile derivatives ya asidi ya ursonic inavyofanya. Kwa hivyo, maarifa ya molekuli yanayounganisha majibu ya ulinzi na saitoskeleton ni tatizo la kuvutia kushughulikiwa. Kwa kutumia uwepo wa misombo yenye uzito mdogo wa molekuli inayohusiana na asidi ya ursoni, pamoja na aina mbalimbali za derivatives zenye uwezo tofauti, zinaweza kutoa fursa za kulenga mifumo isiyojulikana ya seli.
Kwa pamoja, ugunduzi na matumizi ya misombo mipya inayorekebisha mienendo ya mikrotubuli itatoa mbinu zenye nguvu za kushughulikia mifumo tata ya molekuli inayosababisha uamuzi wa umbo la seli ya mmea. Katika muktadha huu, asidi ya urmotonic iliyotengenezwa hivi karibuni, ambayo huathiri mikrotubuli na nyuzi za actini na kusababisha kifo cha seli, inaweza kutoa fursa ya kufafanua uhusiano kati ya udhibiti wa mikrotubuli na mifumo hii mingine. Hivyo, uchambuzi wa kemikali na kibiolojia kwa kutumia asidi ya urbenoniki utatusaidia kuelewa mifumo ya udhibiti wa molekuli inayodhibiti saitoskeletoni ya mmea.
Chanja S. werraensis MK493-CF1 kwenye chupa ya Erlenmeyer yenye ujazo wa mL 500 iliyochanganywa na mchanganyiko yenye mL 110 za mbegu zenye galactose 2% (w/v) 2% (w/v) ya Essence, 1% (w/v) ya mchanganyiko wa Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) dondoo la mahindi (KOGOSTCH Co., Ltd., Japani), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 na 0.2% CaCO3 katika maji yaliyosafishwa. (pH 7.4 kabla ya kuua vijidudu). Mazao ya mbegu yaliwekwa kwenye kifaa cha kusukuma maji (180 rpm) kwa 27°C kwa siku 2. Kilimo cha uzalishaji kupitia uchachushaji wa hali ngumu. Uzalishaji wa mbegu (7 ml) ulihamishiwa kwenye chupa ya K-1 ya mililita 500 yenye gramu 40 za kiyoyozi cha uzalishaji chenye gramu 15 za shayiri iliyoshinikizwa (MUSO Co., Ltd., Japani) na gramu 25 za maji yaliyosafishwa (pH haijarekebishwa kabla ya kuua vijidudu). Uchachushaji ulifanyika kwa joto la 30°C gizani kwa siku 14. Nyenzo ya uchachushaji ilitolewa kwa kutumia mililita 40/chupa ya EtOH na kuchujwa kwa kutumia centrifuge (1500 g, 4°C, dakika 10). Kichocheo cha ufugaji (60 ml) kilitolewa kwa mchanganyiko wa 10% MeOH/EtOAc. Safu ya kikaboni ilivukizwa chini ya shinikizo lililopunguzwa ili kupata mabaki (59.5 mg), ambayo iliwekwa kwenye HPLC kwa kutumia uondoaji wa gradient (dakika 0–10: 90%) kwenye safu ya awamu ya nyuma (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × urefu 250 mm) H2O/CH3CN, dakika 10–35: 90% H2O/CH3CN hadi 70% H2O/CH3CN (gradient), dakika 35–45: 90% H2O/EtOH, dakika 45–155: 90% H2O/EtOH hadi 100% EtOH (gradient (gradient), dakika 155–200: 100% EtOH) kwa kiwango cha mtiririko cha 1.5 ml/dakika, coumamonamide (1, 36.0 mg) ilitengwa kama unga mweupe usio na umbo.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ thamani iliyohesabiwa: 141.0659, thamani iliyopimwa: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Mbegu za Columbia (Col-0) zilipatikana kutoka Kituo cha Rasilimali za Biolojia cha Arabidopsis (ABRC) kwa ruhusa ya matumizi ya utafiti. Mbegu za Col-0 zilipandwa na kutunzwa chini ya hali yetu ya maabara na kutumika kama mimea ya Arabidopsis ya aina ya mwituni. Mbegu za Arabidopsis zilisafishwa juu na kupandwa katika Murashige na Skoog zenye nusu nguvu zenye 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) na 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, kwa 23 °C na mwanga usiobadilika. Mbegu za phs1-1 mutant zilitolewa na T. Hashimoto (Taasisi ya Sayansi na Teknolojia ya Nara).
Mbegu za aina ya SR-1 zilitolewa na T. Hashimoto (Taasisi ya Sayansi na Teknolojia ya Nara) na kutumika kama mimea ya tumbaku ya aina ya mwituni. Mbegu za tumbaku zilisafishwa juu na kulowekwa kwenye maji safi kwa usiku tatu ili kukuza kuota, kisha kuwekwa kwenye mchanganyiko wa nusu-nguvu ulio na 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, na 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. na Skoog medium) yenye pH 5.7 na kuanguliwa kwa 23°C chini ya mwanga usiobadilika.
Strain Tak-1 ilitolewa na T. Kohchi (Chuo Kikuu cha Kyoto) na ilitumika kama kitengo cha kawaida cha majaribio kwa ajili ya utafiti wa liverwort. Gemma ilipatikana kutoka kwa mimea iliyopandwa iliyosafishwa na kisha kufunikwa kwenye Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) iliyo na 1% sucrose na 0.3% gellan gum na kuangushwa kwa 23°C chini ya mwanga unaoendelea.
Seli za Tumbaku za BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Njano angavu 2) zilitolewa na S. Hasezawa (Chuo Kikuu cha Tokyo). Seli za BY-2 zilipunguzwa maji mara 95 katika Linsmeier iliyorekebishwa na Skoog na kuongezewa kila wiki na asidi 2,4-dichlorophenoxyacetic 32. Kiini cha seli kilichanganywa kwenye kitetemeshi kinachozunguka kwa kasi ya 130 rpm kwa 27°C gizani. Osha seli kwa ujazo mara 10 wa kati mpya na urudishe tena katika kati hiyo hiyo. Mistari ya seli ya BY-2 iliyobadilishwa jeni inayoonyesha alama ya microtubule TagRFP-TUA6 au alama ya filament ya actin GFP-ABD2 chini ya kichocheo cha virusi vya koliflawa vya mosaic 35S ilitengenezwa kama ilivyoelezwa33,34,35. Mistari hii ya seli inaweza kudumishwa na kusawazishwa kwa kutumia taratibu zinazofanana na zile zilizotumika kwa mstari wa seli wa awali wa BY-2.
Seli za HeLa zilikuzwa katika Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) iliyoongezewa seramu ya ng'ombe ya fetasi ya 10%, penicillini ya U/ml 1.2, na streptomycin ya 1.2 μg/ml katika kihifadhi cha joto la 37°C chenye 5% CO2.
Majaribio yote yaliyoelezwa katika hati hii yalifanywa kwa mujibu wa kanuni na miongozo ya usalama wa viumbe ya Japani.
Misombo iliyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kama myeyusho wa hisa na kupunguzwa katika mchanganyiko wa MS kwa ajili ya Arabidopsis na tumbaku au Gamborg B5 kwa ajili ya liverwort. Kwa ajili ya jaribio la kuzuia ukuaji wa mizizi, zaidi ya mbegu 10 kwa kila sahani zilipandwa kwenye mchanganyiko wa agar ulio na misombo iliyoonyeshwa au DMSO. Mbegu ziliwekwa kwenye chumba cha ukuaji kwa siku 7. Miche ilipigwa picha na urefu wa mizizi ulipimwa. Kwa jaribio la kuota la Arabidopsis, mbegu 48 kwa kila sahani zilipandwa kwenye mchanganyiko wa agar ulio na misombo 200 μM au DMSO. Mbegu za Arabidopsis zilipandwa kwenye chumba cha ukuaji na idadi ya miche iliyoota ilihesabiwa siku 7 baada ya kuota (dag). Kwa jaribio la kuota la tumbaku, mbegu 24 kwa kila sahani zilipandwa kwenye mchanganyiko wa agar ulio na 200 μM KAND au DMSO. Mbegu za tumbaku zilipandwa kwenye chumba cha ukuaji na idadi ya miche iliyoota ilihesabiwa baada ya siku 14. Kwa ajili ya kipimo cha kuzuia ukuaji wa liverwort, viinitete 9 kutoka kila sahani viliwekwa kwenye sehemu ya kati ya agar iliyo na viwango vilivyoonyeshwa vya KAND au DMSO na kuwekwa kwenye chumba cha ukuaji kwa siku 14.
Tumia miche iliyotiwa rangi ya iodidi ya propidium ya 5 mg/ml (PI) ili kuibua mpangilio wa mizizi ya meristem. Ishara za PI zilizingatiwa kwa hadubini ya fluorescence kwa kutumia darubini ya skanning ya leza ya confocal ya TCS SPE (Leica Microsystems).
Upakaji wa rangi wa mizizi kwa kutumia β-glucuronidase (GUS) ulifanywa kulingana na itifaki iliyoelezwa na Malami na Benfey36. Miche iliwekwa kwenye asetoni 90% usiku kucha, ikawekwa rangi ya 0.5 mg/ml ya 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid katika GUS buffer kwa saa 1 na kuwekwa kwenye myeyusho wa kloraldehyde. (8 g ya kloral hidrati, 2 ml ya maji na 1 ml ya glycerol) na kuzingatiwa kwa hadubini tofauti ya utofautishaji kwa kutumia darubini ya Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Pembe za mizizi zilipimwa kwenye miche ya siku 7 iliyopandwa kwenye sahani zilizowekwa wima. Pima pembe ya mzizi kutoka upande wa vekta ya mvuto kama ilivyoelezwa katika hatua ya 6.
Mpangilio wa mikrotubuli za gamba ulionekana kama ilivyoelezwa, pamoja na marekebisho madogo kwenye itifaki 37. Kingamwili ya anti-β-tubulini (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) na IgG ya kipanya iliyounganishwa na Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) zilitumika kama kingamwili za msingi na za sekondari katika michanganyiko ya 1:1000 na 1:100, mtawalia. Picha za mwangaza zilipatikana kwa kutumia darubini ya skanning ya leza ya confocal ya TCS SPE (Leica Microsystems). Pata picha za Z-stack na uunda makadirio ya kiwango cha juu zaidi kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Upimaji wa kuongezeka kwa seli za HeLa ulifanywa kwa kutumia Kitengo cha Kuhesabu Seli 8 (Dojindo) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Ukuaji wa E. coli DH5α ulichambuliwa kwa kupima msongamano wa seli katika utamaduni kwa kutumia spektrofotomita katika 600 nm (OD600).
Mpangilio wa saitoskeletal katika seli za BY-2 zilizobadilishwa jeni ulizingatiwa kwa kutumia darubini ya fluorescence iliyo na kifaa cha kuchanganua cha CSU-X1 confocal (Yokogawa) na kamera ya sCMOS (Zyla, Andor Technology). Msongamano wa saitoskeletal ulipimwa kwa uchambuzi wa picha, ambao ulipima asilimia ya pikseli za saitoskeletal miongoni mwa pikseli za saitoskeletal katika picha za confocal kwa kutumia programu ya ImageJ kama ilivyoelezwa38,39.
Ili kugundua kifo cha seli katika seli za BY-2, sehemu ndogo ya kusimamishwa kwa seli iliwekwa kwenye kivuli cha bluu cha Evans 0.05% kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida. Madoa teule ya bluu ya Evans ya seli zilizokufa hutegemea kutolewa kwa rangi kutoka kwa seli zinazoweza kuishi na utando wa plasma usioharibika40. Seli zilizotiwa madoa zilizingatiwa kwa kutumia darubini ya uwanja angavu (BX53, Olympus).
Seli za HeLa zilikuzwa katika DMEM zilizoongezewa 10% FBS katika kihifadhi chenye unyevunyevu kwenye 37°C na 5% CO2. Seli zilitibiwa na 100 μM KAND 11, asidi ya kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), au 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) kwa saa 6 kwenye 37°C. Seli zilirekebishwa na MetOH kwa dakika 10 na kisha na asetati kwa dakika 5 kwenye joto la kawaida. Seli zisizorekebishwa ziliwekwa na kingamwili ya msingi ya β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) iliyopunguzwa katika 0.5% BSA/PBS kwa saa 2, zikaoshwa mara 3 na TBST, na kisha zikawekwa na kingamwili ya mbuzi ya Alexa Fluor. 488 Saa 1. – Panya IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) na 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) iliyopunguzwa katika 0.5% BSA/PBS. Baada ya kuosha na TBST mara tatu, seli zilizotiwa rangi zilionekana kwenye darubini iliyogeuzwa ya Nikon Eclipse Ti-E. Picha zilinaswa kwa kutumia kamera ya Hamamatsu ORCA-R2 CCD iliyopozwa kwa kutumia programu ya MetaMorph (Vifaa vya Masi).
Muda wa chapisho: Juni-17-2024