Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matokeo bora zaidi, tunapendekeza kwamba utumie toleo jipya zaidi la kivinjari chako (au zima Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mtindo au JavaScript.
Ugunduzi na matumizi ya manufaa ya bidhaa asili inaweza kusaidia kuboresha maisha ya binadamu.Kemikali za kuzuia ukuaji wa mimea hutumiwa sana kama dawa za kudhibiti magugu.Kwa sababu ya hitaji la kutumia aina tofauti za dawa, kuna haja ya kutambua misombo na njia mpya za utekelezaji.Katika utafiti huu, tuligundua kiwanja cha riwaya N -alkoxypyrrole, coumamonamide, kutoka kwa Streptomyces werraensis MK493-CF1 na kuanzisha mchakato kamili wa usanisi.Kupitia uchanganuzi wa shughuli za kibaolojia, tuligundua kuwa asidi ya urs-monoamic ni kiungo cha kati cha urs-monoamide na kinachoweza kutokea.kizuizi cha ukuaji wa mimea.Zaidi ya hayo, tumeunda viasili mbalimbali vya asidi ya urbenoniki, ikiwa ni pamoja na derivative ya urbenyloxy (UDA), ambayo ina shughuli nyingi za kuua magugu bila kuathiri vibaya ukuaji wa seli za HeLa.Pia tuligundua kuwa derivatives ya asidi ya urmotonic huharibu microtubules za mimea;kwa kuongeza, KAND huathiri filamenti za actin na husababisha kifo cha seli;Athari hizi zenye sura nyingi hutofautiana na zile za vizuizi vya mikrotubule zinazojulikana na zinapendekeza utaratibu mpya wa utekelezaji wa asidi ya ursonic, ambayo inawakilisha faida muhimu katika uundaji wa dawa mpya za kuua magugu.
Ugunduzi na matumizi ya vitendo ya bidhaa za asili za manufaa na derivatives zao ni njia ya kuboresha ubora wa maisha ya binadamu.Metaboli za sekondari zinazozalishwa na microorganisms, mimea na wadudu zimesababisha maendeleo makubwa katika dawa na kilimo.Dawa nyingi za antibiotics na za kupambana na leukemia zimetengenezwa kutoka kwa bidhaa za asili.Aidha, aina mbalimbali zadawa za kuua wadudu, dawa za ukungu na magugu hutolewa kutoka kwa bidhaa hizi za asili kwa matumizi ya kilimo.Hasa, dawa za kudhibiti magugu ni zana muhimu za kuongeza mavuno ya mazao katika kilimo cha kisasa, na aina mbalimbali za misombo tayari kutumika kibiashara.Michakato kadhaa ya seli katika mimea, kama vile usanisinuru, metaboli ya asidi ya amino, usanisi wa ukuta wa seli, udhibiti wa mitosisi, uashiriaji wa phytohormone, au usanisi wa protini, huchukuliwa kuwa malengo ya kawaida ya dawa za kuulia magugu.Viambatanisho vinavyozuia utendakazi wa mikrotubuli ni kundi la kawaida la viua magugu vinavyoathiri ukuaji wa mimea kwa kuathiri kanuni ya mitotiki2.
Microtubules ni vipengele vya cytoskeleton na huhifadhiwa sana katika seli za yukariyoti.Tubulini heterodimer lina α-tubulini na β-tubulini kutengeneza linear microtubule protofilamenti, na protofilamenti 13 kutengeneza muundo silinda.Microtubules hucheza majukumu mengi katika seli za mimea, ikiwa ni pamoja na kuamua umbo la seli, mgawanyiko wa seli, na usafiri wa ndani ya seli3,4.Seli za mimea zina mikrotubuli chini ya utando wa plasma ya interphase, na hizi zinazoitwa microtubules za cortical zinadhaniwa kudhibiti shirika la microfibrils za selulosi kupitia udhibiti wa complexes ya synthase ya selulosi4,5.Mikrotubuli ya gamba ya seli za epidermal ya mizizi, iliyopo katika eneo la kurefuka kwa kasi ya ncha ya mizizi, ziko kando, na nyuzinyuzi za selulosi hufuata mikrotubu hizi na kupunguza mwelekeo wa upanuzi wa seli, na hivyo kukuza urefu wa seli ya anisotropiki.Kwa hiyo, kazi ya microtubule inahusiana kwa karibu na morpholojia ya mimea.Asidi ya amino badala ya jeni katika tubulini ya usimbaji husababisha mkunjo wa mikrotubuli ya gamba na ukuaji wa upande wa kushoto au wa kulia katika Arabidopsis 6,7.Vile vile, mabadiliko katika protini zinazohusiana na microtubule ambayo inadhibiti mienendo ya microtubule inaweza pia kusababisha ukuaji wa mizizi potofu8,9,10,11,12,13.Kwa kuongezea, matibabu kwa kutumia viua magugu vinavyoharibu mikrotubu kama vile disopyramidi, pia inajulikana kama pretilachlor, pia husababisha ukuaji wa mizizi iliyopinda upande wa kushoto14.Takwimu hizi zinaonyesha kuwa udhibiti sahihi wa utendakazi wa mikrotubuli ni muhimu kwa kuamua mwelekeo wa ukuaji wa mmea.
Aina mbalimbali za inhibitors za microtubule zimegunduliwa, na dawa hizi zimetoa mchango mkubwa kwa utafiti wa cytoskeletal, pamoja na kilimo na dawa2.Hasa, oryzalin, misombo ya dinitroaniline, disopyramide, misombo inayohusiana na benzamide, na analogi zao zinaweza kuzuia kazi ya microtubule na hivyo kuzuia ukuaji wa mimea.Kwa hivyo, hutumiwa sana kama dawa za kuua magugu.Hata hivyo, kwa kuwa microtubules ni sehemu muhimu ya seli za mimea na wanyama, inhibitors nyingi za microtubule ni cytotoxic kwa aina zote mbili za seli.Kwa hivyo, licha ya matumizi yao kutambuliwa kama dawa za kuua magugu, idadi ndogo ya mawakala wa antimicrotubule hutumiwa kwa madhumuni ya vitendo.
Streptomyces ni jenasi ya familia ya Streptomyces, ambayo inajumuisha bakteria ya aerobic, gramu-chanya, filamentous na inajulikana sana kwa uwezo wake wa kuzalisha aina mbalimbali za metabolites.Kwa hiyo, inachukuliwa kuwa mojawapo ya vyanzo muhimu zaidi vya bidhaa mpya za asili za biolojia.Katika utafiti wa sasa, tuligundua kiwanja kipya kinachoitwa coumamonamide, ambacho kilitengwa na Streptomyces werraensis MK493-CF1 na S. werraensis ISP 5486. Kutumia uchambuzi wa spectral na uchambuzi kamili wa spectral, muundo wa coumamonamide ulikuwa na sifa na mifupa yake ya kipekee ya N-alkoxypyrrole. iliamuliwa.usanisi.Asidi ya Ursmonic, kiungo cha kati cha ursmonoamide na viambajengo vyake, ilipatikana ili kuzuia ukuaji na uotaji wa mmea maarufu wa Arabidopsis thaliana.Katika utafiti wa uhusiano wa shughuli za muundo, tuligundua kuwa kiambatanisho kilicho na C9 kilichorekebishwa hadi asidi ya ursonic, inayoitwa nonyloxy derivative ya asidi ya ursonic (KAND), huongeza kwa kiasi kikubwa athari ya kuzuia ukuaji na uotaji.Hasa, kizuizi kipya cha ukuaji wa mimea pia kiliathiri ukuaji wa tumbaku na ini na haikuwa cytotoxic kwa bakteria au seli za HeLa.Zaidi ya hayo, baadhi ya derivatives ya asidi ya urmotoniki hushawishi phenotype ya mizizi iliyopotoka, ikimaanisha kuwa derivatives hizi huathiri moja kwa moja au kwa njia isiyo ya moja kwa moja microtubules.Sambamba na wazo hili, uchunguzi wetu wa mikrotubuli iliyo na alama ya kingamwili au kwa protini za fluorescent unaonyesha kuwa matibabu ya KAND hupunguza upolymerizes ya mikrotubuli.Kwa kuongeza, matibabu na derivatives ya asidi ya kumamotonic ilivuruga microfilaments ya actin.Kwa hivyo, tumegundua kizuizi kipya cha ukuaji wa mmea ambacho utaratibu wa kipekee wa utekelezaji unahusisha uharibifu wa cytoskeleton.
Strain MK493-CF1 ilitengwa na udongo huko Shinagawa-ku, Tokyo.Chuja MK493-CF1 iliunda stromal mycelium yenye matawi mazuri.Mlolongo wa sehemu ya jeni la 16S ribosomal RNA (1422 bp) ulibainishwa.Aina hii inafanana sana na S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: shida ya kawaida, 99.93%).Kulingana na matokeo haya, iliamua kuwa aina hii ilikuwa karibu kuhusiana na aina ya S. werraensis.Kwa hivyo, tuliita aina hii kwa muda S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T pia hutoa misombo sawa ya bioactive.Kwa kuwa kulikuwa na utafiti mdogo wa mapema katika kupata bidhaa za asili kutoka kwa microorganism hii, utafiti zaidi wa kemikali ulifanyika.Baada ya kilimo cha S. werraensis MK493-CF1 kwenye shayiri kwa uchachushaji wa hali dhabiti kwa 30°C kwa siku 14, cha kati kilitolewa kwa 50% EtOH.60 ml ya sampuli ilikaushwa ili kupata 59.5 mg ya dondoo ghafi.Dondoo ghafi lilikabiliwa na HPLC ya awamu ya nyuma ili kutoa N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, inayoitwa coumamonamide, 36.0 mg).Jumla ya 1 ni takriban 60% ya dondoo ghafi.Kwa hivyo, tuliamua kusoma kwa undani mali ya kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 ni poda nyeupe ya amorphous na spectrometry ya juu ya azimio kubwa (HRESIMS) inathibitisha C6H8N2O2 (Mchoro 1).Kipande cha pyrrole kilichobadilishwa C2 cha kiwanja hiki kina sifa ya δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH katika wigo wa 1H NMR:4. , H-5) na δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), na wigo wa 13C NMR unaonyesha kuwepo kwa atomi nne za sp2 za kaboni.Uwepo wa kundi la amide katika nafasi ya C2 ulitathminiwa na uwiano wa HMBC kutoka kwa protoni ya C-3 hadi amide carbonyl kaboni katika δC 161.1.Aidha, 1 H na 13 C NMR hufikia kilele kwa δH 4.10 (3H, S) na δC 68.3 zinaonyesha kuwepo kwa vikundi vya N-methoksi katika molekuli.Ingawa msimamo sahihi wa kikundi cha methoksi ulikuwa bado haujaamuliwa kwa kutumia uchanganuzi wa spectroscopic kama vile taswira ya tofauti iliyoimarishwa na ufupisho wa kiboreshaji cha nyuklia (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ikawa kiwanja cha kwanza cha mgombea.
Kuamua muundo sahihi wa 1, awali ya jumla ilifanyika (Mchoro 2a).Matibabu ya 2-aminopyridine 2 inayopatikana kibiashara na m-CPBA ilisababisha N-oksidi 3 inayolingana katika mavuno ya kiasi.Baada ya 2-aminoazidation ya 2, mmenyuko wa cyclocondensation ulioelezewa na Abramovich ulifanywa katika benzini saa 90 ° C ili kupata 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 inayohitajika kwa gramu.Kasi 60% (hatua mbili).15,16.Methylation na hidrolisisi ya 4 kisha ilitoa 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (inayoitwa "cumotonic acid", 6) kwa mavuno mazuri (70%, hatua mbili).Hatimaye, uzuiaji kupitia kloridi ya asidi ya kati 6 kwa kutumia amonia yenye maji ulitoa Kumamoto amide 1 katika mavuno ya 98%.Data zote za spectral za synthesized 1 zilikuwa sawa na 1 pekee, hivyo muundo wa 1 uliamua;
Usanisi wa jumla na uchambuzi wa shughuli za kibiolojia za urbenamide na asidi ya urbenic.(a) Jumla ya awali ya Kumamoto amide.(b) Miche yenye umri wa siku saba aina ya Arabidopsis Columbia (Col) ilikuzwa kwenye sahani za Murashige na Skoog (MS) zenye coumamonamide 6 au coumamonamide 1 kwa viwango vilivyoonyeshwa.Upau wa mizani = 1 cm.
Kwanza, tulitathmini shughuli za kibayolojia za urbenamide na viunzi vyake kwa uwezo wao wa kurekebisha ukuaji wa mimea.Tuliongeza viwango mbalimbali vya ursmonamide 1 au ursmonic acid 6 kwa MS agar medium na miche ya Arabidopsis thaliana iliyopandwa kwenye njia hii.Vipimo hivi vilionyesha kuwa viwango vya juu (500 μM) vya 6 vilizuia ukuaji wa mizizi (Mchoro 2b).Kisha, tulitokeza viasili mbalimbali kwa kubadilisha nafasi ya N1 ya 6 na kufanya tafiti za uhusiano wa shughuli za muundo na shughuli juu yake (mchakato wa usanisi wa analogi unafafanuliwa katika Taarifa Kusaidia (SI)).Miche ya Arabidopsis ilipandwa kwenye kati iliyo na derivatives ya asidi ya ursonic 50 μM, na urefu wa mizizi ulipimwa.kama inavyoonekana kwenye picha.Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 3a, b, na S1, asidi ya coumamo ina urefu tofauti wa minyororo ya alkoksi (9, 10, 11, 12, na 13) au minyororo mikubwa ya alkoksi (15, 16, na 17) kwenye nafasi ya N1.Derivatives ilionyesha kizuizi kikubwa cha ukuaji wa mizizi.Kwa kuongeza, tuligundua kuwa matumizi ya 200 μM 10, 11, au 17 yalizuia kuota (Mtini. 3c na S2).
Utafiti wa uhusiano wa shughuli za muundo wa Kumamoto amide na misombo inayohusiana.(a) Muundo na muundo wa muundo wa analogi.(b) Ukadiriaji wa urefu wa mizizi ya miche yenye umri wa siku 7 iliyokuzwa kwenye MS medium na au bila viasili vya 50 μM vya coumamonamide.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya uwongo (t test, p<0.05).n>18. Data inaonyeshwa kama wastani ± SD.nt inamaanisha "haijajaribiwa" kwa sababu zaidi ya 50% ya mbegu haikuota.(c) Ukadiriaji wa kiwango cha kuota kwa mbegu zilizotibiwa zilizoangaziwa kwa siku 7 kwenye MS medium na au bila 200 μM coumamonamide na misombo inayohusiana nayo.Asterisks zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya sham (mtihani wa chi-mraba).n=96.
Inafurahisha, kuongezwa kwa minyororo ya upande wa alkili kwa muda mrefu zaidi ya C9 ilipunguza shughuli ya kuzuia, na kupendekeza kwamba misombo inayohusiana na asidi ya kumamotoic inahitaji minyororo ya upande ya ukubwa fulani ili kuonyesha shughuli zao za kibiolojia.
Kwa sababu uchanganuzi wa uhusiano wa shughuli za muundo ulionyesha kuwa C9 ilirekebishwa kuwa asidi ya ursonic na derivative ya nonyloksi ya asidi ya ursonic (ambayo baadaye inajulikana kama KAND 11) ilikuwa kizuizi bora zaidi cha ukuaji wa mimea, tulifanya sifa ya kina zaidi ya KAND 11. Matibabu ya Arabidopsis na 50 μM KAND 11 karibu kabisa kuzuia kuota, ambapo viwango vya chini (40, 30, 20, au 10 μM) ya KAND 11 imezuia ukuaji wa mizizi kwa namna inayotegemea kipimo (Mchoro 4a, b).Ili kupima kama KAND 11 inaathiri uwezo wa kumea kwa mizizi, tulichunguza sifa za mizizi zilizo na iodidi ya propidium (PI) na kupima ukubwa wa eneo la meristem.Ukubwa wa meristem ya miche iliyokuzwa kwa wastani iliyo na 25 μM KAND-11 ilikuwa 151.1 ± 32.5 μm, wakati saizi ya meristem ya miche iliyokuzwa kwa njia ya kudhibiti iliyo na DMSO ilikuwa 264.7 ± 30.8 μm (Mchoro 4c, d) , ambayo inaonyesha kuwa KAND-11 hurejesha shughuli za seli.kueneza.Ustahili wa mizizi.Sambamba na hili, matibabu ya KAND 11 yalipunguza kiwango cha alama ya mgawanyiko wa seli CDKB2;1p::CDKB2; ishara ya 1-GUS katika sifa ya mizizi (Mchoro 4e) 17 .Matokeo haya yanaonyesha kuwa KAND 11 huzuia ukuaji wa mizizi kwa kupunguza shughuli za kuenea kwa seli.
Uchambuzi wa athari ya kuzuia ya derivatives ya asidi ya urbenoniki (derivatives ya urbenyloxy) kwenye ukuaji.(a) Miche ya aina ya mwitu ya siku 7 iliyokuzwa kwenye sahani za MS ikiwa na viwango vilivyoonyeshwa vya KAND 11. Upau wa kupima = 1 cm.(b) Uhesabuji wa urefu wa mizizi.Barua zinaonyesha tofauti kubwa (Jaribio la Tukey HSD, uk<0.05).n>16. Data inaonyeshwa kama wastani ± SD.(c) Maikroskopu ya umbo la propidium iodidi iliyo na madoa mwitu aina ya Col mizizi inayokuzwa kwenye bati za MS ikiwa na au bila 25 μM KAND 11. Mabano meupe huonyesha meristem ya mizizi.Upau wa kipimo = 100 µm.(d) Ukadiriaji wa saizi ya mizizi (n = 10 hadi 11).Tofauti za takwimu ziliamuliwa kwa kutumia t-test (p<0.05).Mipau inawakilisha saizi ya wastani inayostahili.(e) Utofautishaji wa uingiliaji tofauti (DIC) hadubini ya sifa kuu iliyo na muundo wa CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS iliyo na madoa na madoa kwenye miche ya siku 5 iliyokuzwa kwenye sahani za MS ikiwa na au bila kipimo cha 25 µM KAND.
Phytotoxicity ya KAND 11 ilijaribiwa zaidi kwa kutumia mmea mwingine wa dicotyledonous, tumbaku (Nicotiana tabacum), na kiumbe kikuu cha mfano wa mmea wa ardhini, liverwort (Marchantia polymorpha).Kama ilivyo kwa Arabidopsis, miche ya tumbaku ya SR-1 iliyopandwa kwa wastani iliyo na 25 μM KAND 11 ilitoa mizizi mifupi (Mchoro 5a).Zaidi ya hayo, mbegu 40 kati ya 48 ziliota kwenye sahani zenye 200 μM KAND 11, ambapo mbegu zote 48 ziliota kwenye vyombo vya habari vilivyofanyiwa mzaha, ikionyesha kwamba viwango vya juu vya KAND vilikuwa muhimu (p.< 0.05;chi test -square) ilizuia kuota kwa tumbaku.(Mchoro 5b).Kwa kuongeza, mkusanyiko wa KAND 11 ambao ulizuia ukuaji wa bakteria katika ini ya ini ulikuwa sawa na ukolezi wa ufanisi katika Arabidopsis (Mchoro 5c).Matokeo haya yanaonyesha kuwa KAND 11 inaweza kuzuia ukuaji wa aina mbalimbali za mimea.Kisha tukachunguza uwezekano wa cytotoxicity ya misombo inayohusiana na dubu monoamide katika viumbe vingine, yaani seli za binadamu za HeLa na aina ya Escherichia coli DH5α, kama wawakilishi wa seli za juu za wanyama na bakteria, mtawalia.Katika mfululizo wa majaribio ya kuenea kwa seli, tuliona kwamba coumamonamide 1, asidi ya coumamonamidic 6, na KAND 11 haikuathiri ukuaji wa seli za HeLa au E. coli katika viwango vya 100 μM (Mchoro 5d, e).
Kizuizi cha ukuaji wa KAND 11 katika viumbe visivyo vya Arabidopsis.(a) Miche ya tumbaku ya aina ya SR-1 ya wiki mbili ilikuzwa kwenye sahani za MS zilizowekwa wima zenye 25 μM KAND 11. (b) Miche ya tumbaku aina ya SR-1 yenye umri wa wiki mbili ilikuzwa kwenye nafasi ya mlalo. Sahani za MS zenye 200 μM KAND 11. ( c) Matawi ya mwitu ya aina ya Tak-1 yenye umri wa wiki mbili yaliyokuzwa kwenye sahani za Gamborg B5 na viwango vilivyoonyeshwa vya KAND 11. Mishale nyekundu huonyesha spora ambazo ziliacha kukua ndani ya wiki mbili za kuangua. kipindi.(d) Upimaji wa kuenea kwa seli za seli za HeLa.Idadi ya seli zinazoweza kutumika ilipimwa kwa vipindi vya muda maalum kwa kutumia kisanduku cha 8 cha kuhesabu seli (Dojindo).Kama udhibiti, seli za HeLa zilitibiwa kwa 5 μg/ml actinomycin D (Sheria D), ambayo huzuia unukuzi wa RNA polymerase na kusababisha kifo cha seli.Uchambuzi ulifanyika katika nakala tatu.(e) Uchunguzi wa kuenea kwa seli za E. koli.Ukuaji wa E. koli ulichanganuliwa kwa kupima OD600.Kama udhibiti, seli zilitibiwa kwa 50 μg/ml ampicillin (Amp), ambayo huzuia usanisi wa ukuta wa seli ya bakteria.Uchambuzi ulifanyika katika nakala tatu.
Ili kubainisha utaratibu wa utendaji wa cytotoxicity inayosababishwa na misombo inayohusiana na uramide, tulichanganua upya viini vya asidi ya urbeni na athari za kuzuia wastani.kama inavyoonekana kwenye picha.Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 2b, 6a, miche iliyopandwa kwenye sahani za agar zenye viwango vya juu (200 μM) ya asidi ya urmotonic 6 ilitoa mizizi mifupi na iliyopinda kushoto (θ = - 23.7 ± 6.1), ambapo miche iliyopandwa kwenye kidhibiti, miche zinazozalishwa karibu mizizi moja kwa moja (θ = - 3.8 ± 7.1).Ukuaji huu wa tabia ya oblique unajulikana kutokana na kutofanya kazi kwa miduara ya gamba14,18.Sambamba na ugunduzi huu, dawa za kupunguza uthabiti wa microtubule, disopyramide na oryzalin zilisababisha kuinamisha kwa mizizi sawa chini ya hali zetu za ukuaji (Mtini. 2b, 6a).Wakati huo huo, tulijaribu derivatives ya asidi ya urmotonic na tukachagua kadhaa kati yao ambayo, kwa viwango fulani, ilisababisha ukuaji wa mizizi ya oblique.Misombo 8, 9, na 15 ilibadilisha mwelekeo wa ukuaji wa mizizi katika 75 μM, 50 μM, na 40 μM, kwa mtiririko huo, ikionyesha kwamba misombo hii inaweza kudhoofisha microtubules kwa ufanisi (Mchoro 2b, 6a).Pia tulijaribu derivative ya asidi ya ursolic yenye nguvu zaidi, KAND 11, katika mkusanyiko wa chini (15 µM) na tukagundua kuwa utumiaji wa KAND 11 ulizuia ukuaji wa mizizi na kwamba mwelekeo wa ukuaji wa mizizi haukuwa sawa, ingawa ulikuwa na mwelekeo wa kuteremka kuelekea kushoto. Kielelezo C3)..Kwa sababu viwango vya juu vya dawa za kuharibu mikrotubuli wakati mwingine huzuia ukuaji wa mmea badala ya kusababisha kuinamisha kwa mizizi, tulitathmini baadaye uwezekano kwamba KAND 11 huathiri mikrotubu kwa kuchunguza mikrotubu ya gamba kwenye seli za epidermal ya mizizi.Immunohistokemia kwa kutumia antibodies za anti-β-tubulini katika seli za epidermal za mizizi ya miche iliyotibiwa na 25 μM KAND 11 ilionyesha kutoweka kwa karibu microtubules zote za cortical katika seli za epidermal katika ukanda wa elongation (Mchoro 6b).Matokeo haya yanaonyesha kuwa asidi ya kumamotoniki na viambajengo vyake hutenda moja kwa moja au isivyo moja kwa moja kwenye mikrotubuli ili kuzivuruga na kwamba misombo hii ni vizuizi vipya vya mikrotubula.
Asidi ya Ursonic na viambajengo vyake hubadilisha mikrotubuli ya gamba katika Arabidopsis thaliana.(a) Pembe ya mwelekeo wa mizizi iliyopimwa kwa kuwepo kwa viasili mbalimbali vya asidi ya uromotoniki katika viwango vilivyoonyeshwa.Madhara ya misombo miwili inayojulikana kuzuia microtubules: disopyramide na oryzalin pia ilichambuliwa.Kipengele cha kuingiza kinaonyesha kiwango kinachotumiwa kupima pembe ya ukuaji wa mizizi.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya uwongo (t test, p<0.05).n>19. Mizani ya bar = 1 cm.(b) Mikrotubuli ya gamba katika seli za epidermal katika eneo la kurefusha.Microtubules katika mizizi ya mwitu ya Arabidopsis Col iliyokuzwa kwenye sahani za MS ikiwa na au bila 25 μM KAND 11 ilionyeshwa kwa uwekaji wa rangi ya kingamwili kwa kutumia kingamwili za msingi za β-tubulini na kingamwili za sekondari za Alexa Fluor-conjugated.Upau wa kipimo = 10 µm.(c) Muundo wa mitotiki wa mikrotubules kwenye meristem ya mizizi.Microtubules zilionyeshwa kwa kutumia rangi ya immunohistochemical.Miundo ya mitotiki, ikiwa ni pamoja na kanda za prophase, spindles, na phragmoplasts, zilihesabiwa kutoka kwa picha za confocal.Mishale inaonyesha miundo ya mitotic microtubule.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa na matibabu ya uwongo (t test, p<0.05).n>9. Upau wa kipimo = 50 µm.
Ingawa Ursa ina uwezo wa kutatiza utendakazi wa mikrotubuli, utaratibu wake wa kutenda unatarajiwa kuwa tofauti na mawakala wa kawaida wa kuondoa upolimishaji mikrotubuli.Kwa mfano, viwango vya juu vya mawakala wa kuondoa upolimishaji mikrotubuli kama vile disopyramidi na oryzalini huchochea upanuzi wa anisotropiki ya seli za ngozi, ilhali KAND 11 haifanyi hivyo.Kwa kuongeza, utumiaji wa ushirikiano wa KAND 11 na disopyramidi ulisababisha mwitikio wa ukuaji wa mizizi uliosababishwa na disopyramidi na kizuizi cha ukuaji cha KAND 11 kilizingatiwa (Mchoro S4).Pia tulichanganua mwitikio wa disopyramidi ya hypersensitive 1-1 (phs1-1) inayobadilika hadi KAND 11. phs1-1 ina mabadiliko ya uhakika ya tubulin kinase isiyo ya kisheria na hutoa mizizi mifupi inapotibiwa na disopyramide9,20.phs1-1 miche ya mutant iliyokuzwa kwenye agar medium iliyo na KAND 11 ilikuwa na mizizi mifupi sawa na ile iliyokuzwa kwenye disopyramid (mtini. S5).
Zaidi ya hayo, tuliona miundo ya mitotubu ya mitotiki, kama vile sehemu za prophase, spindles, na phragmoplasts, kwenye mizizi ya miche iliyotibiwa na KAND 11. Sambamba na uchunguzi wa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, kupungua kwa kiasi kikubwa idadi ya microtubules ya mitotic ilizingatiwa (Mchoro .6c).
Ili kubainisha cytotoxicity ya KAND 11 katika azimio la seli ndogo, tulitibu seli za kusimamishwa za tumbaku BY-2 kwa KAND 11 na kuona majibu yao.Kwanza tuliongeza KAND 11 kwa seli za BY-2 zinazoonyesha TagRFP-TUA6, ambayo huweka lebo za mikrotubula kwa umeme, ili kutathmini athari ya KAND 11 kwenye mirija ya gamba.Uzito wa mikrotubuli ya gamba ilitathminiwa kwa kutumia uchanganuzi wa picha, ambao ulibainisha asilimia ya saizi za sitoskeletal kati ya saitoplazimu saizi.Matokeo ya uchambuzi yalionyesha kuwa baada ya matibabu na 50 μM au 100 μM KAND 11 kwa saa 1, msongamano ulipungua kwa kiasi kikubwa hadi 0.94 ± 0.74% au 0.23 ± 0.28%, mtawaliwa, wakati msongamano wa seli zilizotibiwa na DMSO, ulifikia 10.63 ± 1. % (Kielelezo 7a).Matokeo haya ni sambamba na uchunguzi katika Arabidopsis kwamba KAND 11 matibabu induces depolymerization ya microtubules gamba (Mtini. 6b).Pia tulichunguza mstari wa BY-2 na filamenti za actin zilizo na GFP-ABD baada ya matibabu na mkusanyiko sawa wa KAND 11 na tukagundua kuwa matibabu ya KAND 11 yalivuruga nyuzi za actin.Matibabu na 50 μM au 100 μM KAND 11 kwa h 1 ilipunguza kwa kiasi kikubwa wiani wa actini hadi 1.20 ± 0.62% au 0.61 ± 0.26%, mtawalia, ambapo msongamano katika seli zilizotibiwa na DMSO ulikuwa 1.69 ± 0.51% (Kielelezo 0.51).7b).Matokeo haya yanatofautiana na athari za propyzamide, ambayo haiathiri filamenti za actin, na latrunculin B, depolymerizer ya actin ambayo haiathiri microtubules ( SI Kielelezo S6).Kwa kuongeza, matibabu na coumamonamide 1, asidi ya coumamonamide 6, au KAND 11 haikuathiri microtubules katika seli za HeLa (SI Kielelezo S7).Kwa hivyo, utaratibu wa utekelezaji wa KAND 11 unaaminika kuwa tofauti na ule wa visumbufu vya cytoskeleton vinavyojulikana.Kwa kuongezea, uchunguzi wetu wa hadubini wa seli za BY-2 zilizotibiwa na KAND 11 ulifunua mwanzo wa kifo cha seli wakati wa matibabu ya KAND 11 na ulionyesha kuwa idadi ya seli zilizokufa zilizo na rangi ya samawati ya Evans haikuongezeka sana baada ya dakika 30 ya matibabu ya KAND 11, ilhali. baada ya dakika 90 za matibabu na 50 μM au 100 μM KAND, idadi ya seli zilizokufa iliongezeka hadi 43.7% au 80.1%, kwa mtiririko huo (Mchoro 7c).Ikijumlishwa, data hizi zinaonyesha kuwa riwaya ya derivative ya asidi ya ursolic KAND 11 ni kizuizi maalum cha mimea ya cytoskeletal chenye utaratibu wa utendaji ambao haukujulikana hapo awali.
KAND huathiri mikrotubu ya gamba, nyuzinyuzi za actin, na uwezekano wa chembechembe za BY-2 za tumbaku.(a) Taswira ya mikrotubuli ya gamba katika seli za BY-2 katika uwepo wa TagRFP-TUA6.Seli za BY-2 zilizotibiwa kwa KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini iliyounganishwa.Msongamano wa mikrotubuli ya gamba ulikokotolewa kutoka kwa maikrografu ya seli 25 zinazojitegemea.Barua zinaonyesha tofauti kubwa (Jaribio la Tukey HSD, uk<0.05).Upau wa mizani = 10 µm.(b) Filamenti za gamba la aktini katika seli za BY-2 zinaonekana mbele ya GFP-ABD2.Seli za BY-2 zilizotibiwa kwa KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini iliyounganishwa.Uzito wa filamenti za cortical actin ulihesabiwa kutoka kwa maikrografu ya seli 25 zinazojitegemea.Barua zinaonyesha tofauti kubwa (Jaribio la Tukey HSD, uk<0.05).Upau wa mizani = 10 µm.(c) Uchunguzi wa seli zilizokufa za BY-2 na Evans madoa ya bluu.Seli za BY-2 zilizotibiwa kwa KAND 11 (50 μM au 100 μM) au DMSO zilichunguzwa kwa hadubini ya uga angavu.n=3.Upau wa kipimo = 100 µm.
Ugunduzi na matumizi ya bidhaa mpya za asili umesababisha maendeleo makubwa katika nyanja mbalimbali za maisha ya binadamu, ikiwa ni pamoja na dawa na kilimo.Utafiti wa kihistoria umefanywa ili kupata misombo muhimu kutoka kwa maliasili.Hasa, actinomycetes hujulikana kuwa muhimu kama viuavijasumu vya kuzuia vimelea kwa nematodi kutokana na uwezo wao wa kuzalisha metabolite mbalimbali za upili kama vile avermectin, kiwanja kikuu cha ivermectin na bleomycin na viambajengo vyake, vinavyotumiwa kwa dawa kama wakala wa kuzuia saratani21,22.Kadhalika, aina mbalimbali za misombo ya kuulia magugu imegunduliwa kutoka kwa actinomycetes, ambayo baadhi yake tayari kutumika kibiashara1,23.Kwa hivyo, uchambuzi wa metabolites ya actinomycete ili kutenganisha bidhaa asilia na shughuli za kibaolojia zinazohitajika inachukuliwa kuwa mkakati mzuri.Katika utafiti huu, tuligundua kiwanja kipya, coumamonamide, kutoka kwa S. werraensis na kuitengeneza kwa mafanikio.Asidi ya Ursonic ni syntetisk ya kati ya urbenamide na derivatives yake.Inaweza kusababisha kujikunja kwa mizizi, kuonyesha shughuli za dawa za kuua magugu kwa wastani au kali, na kuharibu mikrotubu ya mimea moja kwa moja au isivyo moja kwa moja.Hata hivyo, utaratibu wa utekelezaji wa asidi ya urmotonic unaweza kutofautiana na inhibitors zilizopo za microtubule, kwa kuwa KAND 11 pia huharibu filaments ya actin na kusababisha kifo cha seli, na kupendekeza utaratibu wa udhibiti ambao asidi ya urmotonic na derivatives yake huathiri miundo mbalimbali ya cytoskeletal..
Tabia ya kina zaidi ya asidi ya urbenoniki itasaidia kuelewa vizuri utaratibu wa hatua ya asidi ya urbenoniki.Hasa, lengo lifuatalo ni kutathmini uwezo wa asidi ya ursonic kujifunga kwa mikrotubuli iliyopunguzwa ili kubaini kama asidi ya ursonic na viambajengo vyake hutenda moja kwa moja kwenye mikrotubuli na kuziondoa upolymeri, au kama kitendo chao husababisha kuharibika kwa mikrotubuli.Kwa kuongeza, katika kesi ambapo microtubules sio lengo la moja kwa moja, kutambua tovuti ya hatua na malengo ya molekuli ya asidi ya ursonic kwenye seli za mimea itasaidia kuelewa zaidi mali ya misombo inayohusiana na njia zinazowezekana za kuboresha shughuli za dawa.Uchambuzi wetu wa shughuli za kibiolojia ulifichua uwezo wa kipekee wa cytotoxic wa asidi ya ursonic juu ya ukuaji wa mimea kama vile Arabidopsis thaliana, tumbaku na ini, wakati seli za E. coli wala HeLa hazikuathiriwa.Sumu kidogo au hakuna kabisa kwa seli za wanyama ni faida ya viingilio vya asidi ya uronic ikiwa vitatengenezwa kama viua magugu kwa matumizi katika mashamba ya wazi ya kilimo.Hakika, kwa kuwa microtubules ni miundo ya kawaida katika yukariyoti, kizuizi chao cha kuchagua katika mimea ni mahitaji muhimu kwa madawa ya kuulia wadudu.Kwa mfano, propyzamide, wakala wa kuondoa upolimishaji mikrotubuli ambayo hufunga moja kwa moja kwenye tubulini na kuzuia upolimishaji, hutumika kama dawa ya kuua magugu kutokana na sumu yake ya chini kwa seli za wanyama24.Tofauti na disopyramidi, benzamide zinazohusiana zina sifa tofauti za shabaha.Mbali na microtubules za mimea, RH-4032 au benzoxamide pia huzuia mikrotubuli ya seli za wanyama au oomycetes, mtawaliwa, na zalilamide hutumiwa kama dawa ya kuua kuvu kutokana na phytotoxicity yake ya chini25,26,27.Dubu wapya na viambajengo vyake huonyesha cytotoxicity maalum dhidi ya mimea, lakini inafaa kuzingatia kwamba marekebisho zaidi yanaweza kubadilisha umaalum wa lengo lao, na hivyo kutoa viingilio vya ziada vya udhibiti wa fangasi wa pathogenic au oomycetes.
Sifa za kipekee za asidi ya urbenoniki na viambajengo vyake ni muhimu kwa maendeleo yao kama dawa za kuulia magugu na kutumika kama zana za utafiti.Umuhimu wa cytoskeleton katika kudhibiti umbo la seli ya mmea unatambuliwa sana.Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa mimea imetoa mifumo changamano ya shirika la mikrotubuli ya gamba kwa kudhibiti mienendo ya mikrotubuli ili kudhibiti ipasavyo mofojenesisi.Idadi kubwa ya molekuli zinazohusika na udhibiti wa shughuli za microtubule zimetambuliwa, na utafiti unaohusiana bado unaendelea3,4,28.Uelewa wetu wa sasa wa mienendo ya mikrotubuli katika seli za mimea hauelezi kikamilifu taratibu za shirika la mikrotubule ya gamba.Kwa mfano, ingawa disopyramidi na oryzalin zinaweza kuondoa mikrotubuli, disopyramidi husababisha kuvuruga kwa mizizi huku oryzalin ikiwa na athari kidogo.Zaidi ya hayo, mabadiliko katika tubulini, ambayo huimarisha microtubules, pia husababisha dextrorotation katika mizizi, ambapo paclitaxel, ambayo pia huimarisha mienendo ya microtubule, haifanyi.Kwa hivyo, kusoma na kutambua malengo ya molekuli ya asidi ya ursolic inapaswa kutoa maarifa mapya katika udhibiti wa microtubules za gamba la mimea.Vile vile, ulinganisho wa siku zijazo wa kemikali ambazo zinafaa katika kukuza ukuaji potofu, kama vile disopyramidi, na kemikali zisizo na ufanisi, kama vile oryzalin au asidi ya kumamotoriki, itatoa vidokezo vya jinsi ukuaji potofu hutokea.
Kwa upande mwingine, upangaji upya wa cytoskeletal unaohusiana na ulinzi ni uwezekano mwingine wa kuelezea cytotoxicity ya asidi ya ursonic.Kuambukizwa kwa pathojeni au kuingizwa kwa kichochezi kwenye seli za mimea wakati mwingine husababisha uharibifu wa cytoskeleton na kifo cha seli baadae29.Kwa mfano, cryptoxanthin inayotokana na oomycete imeripotiwa kuvuruga mikrotubuli na filamenti za actin kabla ya kifo cha seli ya tumbaku, sawa na kile kinachotokea kwa matibabu ya KAND30,31.Kufanana kati ya majibu ya ulinzi na majibu ya seli yanayotokana na asidi ya ursonic kulitufanya kudhania kwamba huanzisha michakato ya kawaida ya seli, ingawa athari ya haraka na yenye nguvu ya asidi ya ursonic kuliko cryptoxanthin inaonekana.Hata hivyo, tafiti zimeonyesha kwamba kuvuruga kwa filamenti za actin kunakuza kifo cha chembe chembe, ambacho mara zote hakiambatani na kukatika kwa mikrotubu29.Kwa kuongeza, inabakia kuonekana ikiwa pathojeni au kichochezi husababisha ukuaji wa mizizi potofu, kama vile viini vya asidi ya ursonic hufanya.Kwa hivyo, ujuzi wa molekuli unaounganisha majibu ya ulinzi na cytoskeleton ni tatizo la kuvutia kushughulikiwa.Kwa kutumia uwepo wa misombo ya chini ya uzito wa molekuli inayohusiana na asidi ya ursonic, pamoja na aina mbalimbali ya derivatives yenye nguvu tofauti, inaweza kutoa fursa za kulenga mifumo ya seli isiyojulikana.
Ikizingatiwa pamoja, ugunduzi na utumiaji wa misombo mipya ambayo hurekebisha mienendo ya mikrotubuli itatoa mbinu dhabiti kushughulikia mifumo changamano ya molekuli msingi wa uamuzi wa umbo la seli ya mmea.Katika muktadha huu, asidi ya urmotoniki iliyotengenezwa hivi majuzi, ambayo huathiri mikrotubuli na filamenti za actin na kusababisha kifo cha seli, inaweza kutoa fursa ya kubainisha uhusiano kati ya udhibiti wa mikrotubu na taratibu hizi nyingine.Kwa hivyo, uchambuzi wa kemikali na kibaolojia kwa kutumia asidi ya urbenoniki utatusaidia kuelewa taratibu za udhibiti wa molekuli zinazodhibiti cytoskeleton ya mmea.
Chanja S. werraensis MK493-CF1 kwenye chupa ya Erlenmeyer yenye mililita 500 iliyo na mililita 110 ya kati ya mbegu inayojumuisha 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% ( w/v) Muundo wa Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) dondoo la mahindi (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 na 0.2% CaCO3 katika maji yaliyotolewa.(pH 7.4 kabla ya sterilization).Tamaduni za mbegu ziliwekwa kwenye shaker ya kuzunguka (180 rpm) kwa 27 ° C kwa siku 2.Kilimo cha uzalishaji kupitia uchachushaji wa hali dhabiti.Utamaduni wa mbegu (7 ml) ulihamishiwa kwenye chupa ya 500 ml K-1 iliyo na 40 g ya njia ya uzalishaji inayojumuisha 15 g ya shayiri iliyoshinikizwa (MUSO Co., Ltd., Japan) na 25 g ya maji yaliyotolewa (pH haijarekebishwa. kabla ya sterilization).)Fermentation ilifanyika kwa 30 ° C katika giza kwa siku 14.Nyenzo ya kuchachusha ilitolewa kwa 40 ml/chupa ya EtOH na kuwekwa katikati (1500 g, 4°C, dk 10).Dawa ya ajabu ya kitamaduni (mililita 60) ilitolewa kwa mchanganyiko wa 10% MeOH/EtOAc.Safu ya kikaboni iliyeyushwa chini ya shinikizo lililopunguzwa ili kupata mabaki (miligramu 59.5), ambayo iliathiriwa na HPLC na upungufu wa upinde rangi (dakika 0-10: 90%) kwenye safu wima ya awamu ya nyuma (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID. 10 mm × urefu 250 mm) H2O/CH3CN, dakika 10–35: 90% H2O/CH3CN hadi 70% H2O/CH3CN (gradient), dakika 35–45: 90% H2O/EtOH, dakika 45–155: 90% H2O /EtOH hadi 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) katika kiwango cha mtiririko wa 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) ilitengwa kama unga mweupe wa amofasi.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ thamani iliyohesabiwa: 141.0659, thamani iliyopimwa: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Mbegu za Columbia (Col-0) zilipatikana kutoka kwa Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kwa ruhusa ya matumizi ya utafiti.Mbegu za Col-0 zilienezwa na kudumishwa chini ya hali zetu za maabara na kutumika kama mimea ya mwitu ya Arabidopsis.Mbegu za Arabidopsis zilizaa kwa uso na kukuzwa katika nusu-nguvu Murashige na Skoog kati zenye 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical )) na 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, saa 23 °C na mwanga usiobadilika.Mbegu za phs1-1 mutant zilitolewa na T. Hashimoto (Taasisi ya Sayansi na Teknolojia ya Nara).
Mbegu za aina ya SR-1 zilitolewa na T. Hashimoto (Taasisi ya Sayansi na Teknolojia ya Nara) na kutumika kama mimea ya aina ya tumbaku.Mbegu za tumbaku zilichujwa na kulowekwa kwenye maji yasiyo na uchafu kwa siku tatu ili kuota, kisha kuwekwa kwenye myeyusho wa nusu-nguvu wenye 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, na 0.8% ya gamu ya gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.na Skoog medium) yenye pH 5.7 na incubated saa 23°C chini ya mwanga usiobadilika.
Strain Tak-1 ilitolewa na T. Kohchi (Chuo Kikuu cha Kyoto) na ilitumika kama kitengo cha majaribio cha kawaida cha utafiti wa ini.Gemma ilipatikana kutoka kwa mimea iliyooteshwa na kisha kuwekwa kwenye Gamborg B5 kati (Fujifilm Wako Pure Chemical) iliyo na 1% sucrose na 0.3% ya gum ya gellani na kuangaziwa kwa 23°C chini ya mwanga usiokoma.
Seli za Tumbaku BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Manjano Inayong'aa 2) zilitolewa na S. Hasezawa (Chuo Kikuu cha Tokyo).Seli za BY-2 zilipunguzwa mara 95 katika Linsmeier na Skoog iliyorekebishwa na kuongezwa kila wiki kwa asidi 2,4-dichlorophenoxyacetic 32.Kusimamishwa kwa seli kulichanganywa kwenye shaker ya rotary saa 130 rpm saa 27 ° C katika giza.Osha seli kwa mara 10 ya ujazo wa kati safi na usimamishe tena kwa njia ile ile.Mistari ya seli ya BY-2 inayoonyesha kwa uthabiti alama ndogo ya TagRFP-TUA6 au alama ya filamenti ya actin GFP-ABD2 chini ya kikuzaji cha 35S ya virusi vya cauliflower mosaic ilitolewa kama ilivyoelezwa33,34,35.Laini hizi za seli zinaweza kudumishwa na kusawazishwa kwa kutumia taratibu zinazofanana na zile zinazotumika kwa laini asili ya BY-2.
Seli za HeLa zilikuzwa katika Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) iliyorekebishwa ya Dulbecco iliyoongezwa 10% ya seramu ya ng'ombe wa fetasi, penicillin 1.2 U/ml, na 1.2 μg/ml streptomycin katika incubator ya 37°C yenye 5% CO2.
Majaribio yote yaliyofafanuliwa katika muswada huu yalifanywa kwa mujibu wa kanuni na miongozo ya usalama wa viumbe ya Kijapani.
Misombo iliyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kama suluhu za hisa na kuongezwa kwa MS medium kwa Arabidopsis na tumbaku au Gamborg B5 medium kwa ini.Kwa kipimo cha kuzuia ukuaji wa mizizi, zaidi ya mbegu 10 kwa sahani zilipandwa kwenye chombo cha agar kilicho na misombo iliyoonyeshwa au DMSO.Mbegu zimewekwa kwenye chumba cha ukuaji kwa siku 7.Miche ilipigwa picha na urefu wa mizizi ulipimwa.Kwa uchunguzi wa uotaji wa Arabidopsis, mbegu 48 kwa kila sahani zilipandwa kwenye chombo cha agar kilicho na 200 μM au DMSO.Mbegu za Arabidopsis zilikuzwa kwenye chumba cha ukuaji na idadi ya miche iliyoota ilihesabiwa siku 7 baada ya kuota (dag).Kwa kipimo cha uotaji wa tumbaku, mbegu 24 kwa kila sahani zilipandwa kwenye agar medium iliyo na 200 μM KAND au DMSO.Mbegu za tumbaku zilikuzwa kwenye chumba cha ukuaji na idadi ya miche iliyoota ilihesabiwa baada ya siku 14.Kwa kipimo cha kuzuia ukuaji wa ini, viinitete 9 kutoka kwa kila sahani viliwekwa kwenye chombo cha agar kilicho na viwango vilivyoainishwa vya KAND au DMSO na kuangaziwa katika chumba cha ukuaji kwa siku 14.
Tumia miche iliyotiwa madoa ya 5 mg/ml ya propidium iodide (PI) ili kuibua mpangilio mzuri wa mizizi.Ishara za PI zilizingatiwa na hadubini ya fluorescence kwa kutumia hadubini ya utambazaji ya leza ya TCS SPE (Leica Microsystems).
Uchafuzi wa histokemikali wa mizizi na β-glucuronidase (GUS) ulifanyika kulingana na itifaki iliyoelezwa na Malami na Benfey36.Miche iliwekwa katika 90% ya asetoni kwa usiku mmoja, iliyotiwa rangi na 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic asidi katika GUS buffer kwa saa 1 na kuwekwa katika suluji ya hidrati ya kloraldehyde.(8 g hidrati ya klori, 2 ml ya maji na 1 ml gliserili) na kuzingatiwa na hadubini ya utofautishaji wa uingiliaji tofauti kwa kutumia hadubini ya Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Pembe za mizizi zilipimwa kwenye miche yenye umri wa siku 7 iliyopandwa kwenye sahani zilizowekwa wima.Pima pembe ya mzizi kutoka kwa mwelekeo wa vekta ya mvuto kama ilivyoelezwa katika hatua ya 6.
Mpangilio wa microtubules za gamba ulizingatiwa kama ilivyoelezwa, na marekebisho madogo kwa itifaki 37 .Kingamwili ya anti-β-tubulini (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) na Alexa Fluor 488-conjugated anti-panya IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) zilitumika kama kingamwili za msingi na sekondari katika 1:1000 na 1:100 dilutions, kwa mtiririko huo.Picha za fluorescence zilipatikana kwa kutumia hadubini ya TCS SPE ya kuchanganua leza (Leica Microsystems).Pata picha za Z-stack na uunda makadirio ya kiwango cha juu kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Upimaji wa ueneaji wa seli za HeLa ulifanyika kwa kutumia Zana ya Kuhesabia Seli 8 (Dojindo) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Ukuaji wa E. koli DH5α ulichanganuliwa kwa kupima msongamano wa seli katika utamaduni kwa kutumia spectrophotometer katika 600 nm (OD600).
Shirika la cytoskeletal katika seli za transgenic BY-2 lilionekana kwa kutumia darubini ya fluorescence iliyo na kifaa cha skanning cha CSU-X1 (Yokogawa) na kamera ya sCMOS (Zyla, Andor Technology).Msongamano wa cytoskeletal ulitathminiwa na uchanganuzi wa picha, ambao ulikadiria asilimia ya saizi za cytoskeletal kati ya saitoplazimu saizi katika picha zilizounganishwa kwa kutumia programu ya ImageJ kama ilivyoelezwa38,39.
Ili kugundua kifo cha seli katika seli za BY-2, aliquot ya kusimamishwa kwa seli iliwekwa ndani na 0.05% Evans bluu kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida.Uchafuaji wa rangi ya bluu wa Evans wa seli zilizokufa hutegemea uchujaji wa rangi kutoka kwa seli zinazoweza kutumika na utando wa plazima40.Seli zenye madoa zilizingatiwa kwa kutumia darubini ya uwanja angavu (BX53, Olympus).
Seli za HeLa zilikuzwa katika DMEM zikisaidiwa na 10% FBS katika incubator iliyo na unyevu wa 37°C na 5% CO2.Seli zilitibiwa kwa 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), au 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) kwa saa 6 kwa 37°C.Seli ziliwekwa kwa MetOH kwa dakika 10 na kisha kwa acetate kwa dakika 5 kwenye joto la kawaida.Seli zisizohamishika ziliwekwa ndani ya kingamwili ya msingi ya β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) iliyopunguzwa katika 0.5% BSA/PBS kwa saa 2, ikaoshwa mara 3 na TBST, na kisha kuingizwa na kingamwili ya mbuzi ya Alexa Fluor.488 1 saa.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) na 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) iliyopunguzwa katika 0.5% BSA/PBS.Baada ya kuosha na TBST mara tatu, seli zilizo na madoa zilizingatiwa kwenye darubini iliyogeuzwa ya Nikon Eclipse Ti-E.Picha zilinaswa kwa kamera iliyopozwa ya Hamamatsu ORCA-R2 CCD kwa kutumia programu ya MetaMorph (Vifaa vya Molekuli).
Muda wa kutuma: Juni-17-2024