Nematodi ya pine ni endoparasite inayohama ya karantini inayojulikana kusababisha hasara kubwa za kiuchumi katika mifumo ikolojia ya misitu ya misonobari. Utafiti wa sasa unakagua shughuli ya nematicidal ya indoles za halojeni dhidi ya nematodes ya pine na utaratibu wao wa utekelezaji. Shughuli za nematicidal za 5-iodoindole na avermectin (udhibiti chanya) dhidi ya nematodi za pine zilikuwa sawa na za juu katika viwango vya chini (10 μg/mL). 5-iodoindole ilipunguza uzazi, shughuli za uzazi, vifo vya kiinitete na lava, na tabia ya locomotor. Mwingiliano wa molekuli ya ligandi zilizo na vipokezi vya chaneli ya kloridi yenye uti wa mgongo maalum ya glutamate-gated inaunga mkono dhana kwamba 5-iodoindole, kama vile avermectin, hufungamana kwa nguvu kwenye tovuti amilifu ya vipokezi. 5-Iodoindole pia ilisababisha kasoro mbalimbali za phenotypic katika nematodi, ikiwa ni pamoja na kuporomoka/kusinyaa kwa chombo na kuongezeka kwa vacuolization. Matokeo haya yanaonyesha kwamba vakuli zinaweza kuwa na jukumu katika kifo cha nematode methylation-mediated. Muhimu zaidi, 5-iodoindole haikuwa na sumu kwa aina zote za mimea (kabichi na figili). Kwa hivyo, utafiti huu unaonyesha kuwa utumiaji wa iodoindole chini ya hali ya mazingira unaweza kudhibiti jeraha la mnyauko wa pine.
Nematodi ya miti ya pine (Bursaphelenchus xylophilus) ni ya viwavi vya miti ya pine (PWN), nematodi wadudu wanaohama wanaojulikana kusababisha uharibifu mkubwa wa kiikolojia kwa mifumo ikolojia ya misitu ya misonobari1. Ugonjwa wa mnyauko wa pine (PWD) unaosababishwa na nematode ya miti ya pine unakuwa tatizo kubwa katika mabara kadhaa, ikiwa ni pamoja na Asia na Ulaya, na katika Amerika ya Kaskazini, nematode huharibu aina ya pine1,2. Kupungua kwa miti ya misonobari ni tatizo kubwa la kiuchumi, na matarajio ya kuenea kwake kimataifa ni ya kutia wasiwasi3. Aina zifuatazo za misonobari hushambuliwa zaidi na nematodi: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, na Pinus radiata4. Pine nematode ni ugonjwa mbaya ambao unaweza kuua miti ya misonobari ndani ya wiki au miezi kadhaa baada ya kuambukizwa. Kwa kuongeza, milipuko ya nematode ya pine ni ya kawaida katika mifumo mbalimbali ya ikolojia, hivyo minyororo ya maambukizi ya kudumu imeanzishwa1.
Bursaphelenchus xylophilus ni nematodi ya mmea-vimelea ya karantini inayomilikiwa na familia kuu ya Aphelenchoidea na clade 102.5. Nematode hula kuvu na kuzaliana katika tishu za miti ya misonobari, hukua katika hatua nne tofauti za mabuu: L1, L2, L3, L4 na mtu mzima1,6. Chini ya hali ya uhaba wa chakula, nematode ya pine hupita kwenye hatua maalum ya mabuu - dauer, ambayo huharibu vector yake - beetle ya gome la pine (Monochamus alternatus) na kuhamishiwa kwenye miti ya pine yenye afya. Katika majeshi yenye afya, nematodi huhamia haraka kupitia tishu za mimea na kulisha seli za parenchymatous, ambayo husababisha idadi ya athari za hypersensitivity, kunyauka kwa pine na kifo ndani ya mwaka baada ya kuambukizwa1,7,8.
Udhibiti wa kibayolojia wa viwavi wa misonobari umekuwa changamoto kwa muda mrefu, huku hatua za kuweka karantini zikianzia karne ya 20. Mikakati ya sasa ya kudhibiti nematodi ya misonobari inahusisha matibabu ya kemikali, ikijumuisha ufukizaji wa kuni na uwekaji wa dawa za kuua wadudu kwenye mashina ya miti. Dawa za kuua nematicide zinazotumika sana ni avermectin na avermectin benzoate, ambazo ni za familia ya avermectin. Kemikali hizi za bei ghali ni nzuri sana dhidi ya spishi nyingi za nematode na huchukuliwa kuwa salama kwa mazingira9. Walakini, matumizi ya mara kwa mara ya nematicides haya yanatarajiwa kuunda shinikizo la uteuzi ambalo hakika litasababisha kuibuka kwa nematodes sugu ya pine, kama inavyoonyeshwa kwa wadudu kadhaa wadudu, kama vile Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella na nematodes Trichostrongylus colubriformis na Ostertagia ambayo imekuza upinzani wa12 hatua kwa hatua. Kwa hivyo, mifumo ya ukinzani inahitaji kuchunguzwa mara kwa mara na dawa za kuua nemati kuchunguzwa kila mara ili kupata hatua mbadala, za gharama nafuu na rafiki wa mazingira ili kudhibiti PVD. Katika miongo ya hivi karibuni, idadi ya waandishi wamependekeza matumizi ya dondoo za mimea, mafuta muhimu na tete kama mawakala wa kudhibiti nematode13,14,15,16.
Hivi majuzi tulionyesha shughuli ya nematicidal ya indole, molekuli ya kuashiria baina ya seli na mataifa, katika Caenorhabditis elegans 17 . Indole ni ishara iliyoenea ya ndani ya seli katika ikolojia ya viumbe vidogo, kudhibiti kazi nyingi zinazoathiri fiziolojia ya microbial, malezi ya spore, utulivu wa plasmid, upinzani wa madawa ya kulevya, uundaji wa biofilm, na virulence 18, 19 . Shughuli ya indole na derivatives yake dhidi ya nematodes nyingine za pathogenic haijasoma. Katika utafiti huu, tulichunguza shughuli ya nematicidal ya indoli 34 dhidi ya nematodi za misonobari na kufafanua utaratibu wa utendaji wa 5-iodoindole yenye nguvu zaidi kwa kutumia hadubini, upigaji picha unaopita muda na majaribio ya uwekaji wa molekuli, na kutathmini athari zake za sumu kwa mimea kwa kutumia kipimo cha uotaji wa mbegu.
Viwango vya juu (> 1.0 mM) vya indole vimeripotiwa hapo awali kuwa na athari ya nematodes17. Kufuatia matibabu ya B. xylophilus (hatua zilizochanganywa za maisha) na indole au derivatives 33 tofauti za indole katika mm 1, vifo vya B. xylophilus vilipimwa kwa kuhesabu nematode hai na iliyokufa katika vikundi vya kudhibiti na kutibiwa. Indoles tano zilionyesha shughuli muhimu ya nemacidal; uhai wa kikundi cha udhibiti ambacho hakijatibiwa kilikuwa 95 ± 7% baada ya 24 h. Kati ya indoles 34 zilizojaribiwa, 5-iodoindole na 4-fluoroindole katika 1 mm zilisababisha vifo vya 100%, ambapo 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate, na 7-iodoindole zilisababisha takriban 50% ya vifo (Jedwali 1).
Athari ya 5-iodoindole kwenye uundaji wa vakuli na kimetaboliki ya nematode ya kuni ya pine. (A) Athari ya avermectin na 5-iodoindole kwa nematodi za kiume zilizokomaa, (B) hatua ya L1 ya mayai ya nematodi na (C) kimetaboliki ya B. xylophilus, (i) vakuoles hazikuzingatiwa saa 0, matibabu yalisababisha (ii) vakuoles, (iii) mkusanyiko wa vacuoles nyingi, vacuoles, (iv) na (vi) uundaji wa vakuli kubwa. Mishale nyekundu inaonyesha uvimbe wa vacuoles, mishale ya bluu inaonyesha fusion ya vacuoles na mishale nyeusi inaonyesha vacuoles kubwa. Upau wa kiwango = 50 μm.
Kwa kuongeza, utafiti huu pia ulielezea mchakato wa mfululizo wa kifo cha methane-ikiwa katika nematodes ya pine (Kielelezo 4C). Kifo cha Methanojeni ni aina isiyo ya apoptotic ya kifo cha seli inayohusishwa na mkusanyiko wa vakuli maarufu za cytoplasmic27. Kasoro za kimofolojia zinazozingatiwa katika nematode za pine zinaonekana kuwa na uhusiano wa karibu na utaratibu wa kifo kinachosababishwa na methane. Uchunguzi wa hadubini kwa nyakati tofauti ulionyesha kuwa vakuli kubwa ziliundwa baada ya saa 20 za kufichuliwa na 5-iodoindole (0.1 mM). Vakuoles za microscopic zilizingatiwa baada ya saa 8 za matibabu, na idadi yao iliongezeka baada ya 12 h. Vacuoles kubwa kadhaa zilizingatiwa baada ya 14 h. Vakuoles kadhaa zilizounganishwa zilionekana wazi baada ya h 12-16 ya matibabu, ikionyesha kuwa mchanganyiko wa vakuli ni msingi wa utaratibu wa kifo cha methanogenic. Baada ya masaa 20, vacuoles kadhaa kubwa zilipatikana katika mdudu. Uchunguzi huu unawakilisha ripoti ya kwanza ya metuosis katika C. elegans.
Katika minyoo 5-iodoindole-kutibiwa, aggregation vacuole na kupasuka pia aliona (Mtini. 5), kama inavyothibitishwa na minyoo bending na vacuole kutolewa katika mazingira. Usumbufu wa vacuole pia ulionekana kwenye utando wa ganda la yai, ambalo kwa kawaida huhifadhiwa na L2 wakati wa kuanguliwa (Mchoro wa ziada wa S2). Uchunguzi huu unasaidia ushiriki wa mkusanyiko wa maji na kushindwa kwa osmoregulatory, pamoja na kuumia kwa seli inayoweza kubadilika (RCI), katika mchakato wa uundaji wa vacuole na suppuration (Mchoro 5).
Kukisia dhima ya iodini katika uundaji wa vakuli iliyozingatiwa, tulichunguza shughuli ya nematicidal ya iodidi ya sodiamu (NaI) na iodidi ya potasiamu (KI). Hata hivyo, katika viwango (0.1, 0.5 au 1 mM), hazikuathiri maisha ya nematode au uundaji wa vacuole (Mchoro wa ziada wa S5), ingawa 1 mM KI ilikuwa na athari kidogo ya nematicidal. Kwa upande mwingine, 7-iodoindole (1 au 2 mm), kama 5-iodoindole, ilisababisha vakuli nyingi na uharibifu wa miundo (Mchoro wa ziada wa S6). Iodoindoles mbili zilionyesha sifa sawa za phenotypic katika nematodes ya pine, ambapo NaI na KI hazikufanya. Inashangaza, indole haikusababisha uundaji wa vacuole katika B. xylophilus katika viwango vilivyojaribiwa (data haijaonyeshwa). Kwa hivyo, matokeo yalithibitisha kuwa tata ya indole-iodini inawajibika kwa utupushaji na kimetaboliki ya B. xylophilus.
Miongoni mwa indoles zilizojaribiwa kwa shughuli za nematicidal, 5-iodoindole ilikuwa na index ya juu ya kuingizwa ya -5.89 kcal / mol, ikifuatiwa na 7-iodoindole (-4.48 kcal / mol), 4-fluoroindole (-4.33), na indole (-4.03) (Mchoro 6). Muunganisho thabiti wa hidrojeni wa uti wa mgongo wa 5-iodoindole hadi leucine 218 huimarisha ufungaji wake, ilhali viambajengo vingine vyote vya indole hufunga kwenye serine 260 kupitia bondi za hidrojeni za upande. Miongoni mwa iodoindoles nyingine za mfano, 2-iodoindole ina thamani ya kisheria ya -5.248 kcal/mol, ambayo ni kutokana na dhamana yake kuu ya hidrojeni na leucine 218. Vifungo vingine vinavyojulikana ni pamoja na 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal 6/moloi) 6. kcal/mol) (Mchoro wa Nyongeza S8). Indole nyingi zenye halojeni na indole zenyewe, isipokuwa 5-iodoindole na 2-iodoindole, huunda dhamana na serine 260. Ukweli kwamba kuunganisha hidrojeni na leucine 218 ni dalili ya kumfunga kwa ufanisi wa kipokezi, kama inavyoonekana kwa ivermectin (Nyongeza7), inathibitisha kwamba Sle-7 Mtini. 2-iodoindole, kama ivermectin, hujifunga kwa nguvu kwenye tovuti inayotumika ya kipokezi cha GluCL kupitia leucine 218 (Mchoro 6 na Kielelezo cha Nyongeza. S8). Tunapendekeza kwamba ufungaji huu unahitajika ili kudumisha muundo wa pore wazi wa changamano la GluCL na kwamba kwa kujifunga kwa uthabiti kwenye tovuti inayotumika ya kipokezi cha GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin na ivermectin hivyo kudumisha chaneli ya ioni wazi na kuruhusu unywaji wa maji.
Uwekaji wa molekuli ya indole na indole ya halojeni kwa GluCL. Mielekeo inayofunga ya (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, na (D) ligandi 5-iodoindole kwenye tovuti inayotumika ya GluCL. Protini inawakilishwa na utepe, na vifungo vya hidrojeni vya uti wa mgongo vinaonyeshwa kama mistari yenye vitone vya manjano. (A′), (B′), (C′), na (D′) huonyesha mwingiliano wa kano zinazolingana na mabaki ya asidi ya amino yanayozunguka, na vifungo vya hidrojeni vya kando vinaonyeshwa kwa mishale yenye vitone waridi.
Majaribio yalifanyika ili kutathmini athari ya sumu ya 5-iodoindole kwenye kuota kwa mbegu za kabichi na radish. 5-iodoindole (0.05 au 0.1 mM) au avermectin (10 μg/mL) ilikuwa na athari kidogo au haikuwa na athari yoyote kwenye uotaji wa awali na kuchipuka kwa mimea (Mchoro 7). Kwa kuongeza, hakuna tofauti kubwa iliyopatikana kati ya kiwango cha kuota kwa udhibiti usiotibiwa na mbegu zilizotibiwa na 5-iodoindole au avermectin. Athari ya kurefusha mzizi na idadi ya mizizi ya kando iliyoundwa haikuwa na maana, ingawa 1 mm (mara 10 ukolezi wake amilifu) ya 5-iodoindole ilichelewesha kidogo ukuaji wa mizizi ya upande. Matokeo haya yanaonyesha kuwa 5-iodoindole haina sumu kwa seli za mimea na haiingiliani na michakato ya ukuaji wa mimea katika viwango vilivyosomwa.
Athari ya 5-iodoindole kwenye uotaji wa mbegu. Kuota, kuchipua na kuweka mizizi kando ya mbegu za B. oleracea na R. raphanistrum kwenye Murashige na Skoog agar medium na au bila avermectin au 5-iodoindole. Kuota kunarekodiwa baada ya siku 3 za incubation kwa 22°C.
Utafiti huu unaripoti visa kadhaa vya mauaji ya nematode na indoles. Muhimu zaidi, hii ni ripoti ya kwanza ya iodoindole inducing methylation (mchakato unaosababishwa na mkusanyiko wa vacuoles ndogo kwamba hatua kwa hatua kuunganisha katika vacuoles kubwa, hatimaye kusababisha kupasuka kwa membrane na kifo) katika pine sindano, na iodoindole kuonyesha sifa muhimu nematicidal sawa na wale wa kibiashara nematicide avermectin.
Indoles zimeripotiwa hapo awali kufanya kazi nyingi za kuashiria katika prokariyoti na yukariyoti, ikiwa ni pamoja na kizuizi / malezi ya biofilm, kuishi kwa bakteria, na pathogenicity19,32,33,34. Hivi majuzi, athari za matibabu zinazowezekana za indole zilizo na halojeni, alkaloidi za indole, na viambajengo vya indole vya semisynthetic vimevutia utafiti wa kina35,36,37. Kwa mfano, indoli zenye halojeni zimeonyeshwa kuua Escherichia coli na seli za Staphylococcus aureus37. Kwa kuongeza, ni jambo la manufaa la kisayansi kuchunguza ufanisi wa indoles zilizo na halojeni dhidi ya aina nyingine, genera, na falme, na utafiti huu ni hatua ya kufikia lengo hili.
Hapa, tunapendekeza utaratibu wa kuua 5-iodoindole-ikiwa katika C. elegans kulingana na jeraha la seli linaloweza kurekebishwa (RCI) na methylation (Takwimu 4C na 5). Mabadiliko ya uvimbe kama vile uvimbe na kuzorota kwa vakuli ni viashiria vya RCI na methylation, inayoonyeshwa kama vakuli kubwa katika saitoplazimu48,49. RCI inaingilia uzalishaji wa nishati kwa kupunguza uzalishaji wa ATP, na kusababisha kushindwa kwa pampu ya ATPase, au kuharibu utando wa seli na kusababisha kuingia kwa kasi kwa Na+, Ca2+, na maji50,51,52. Vakuoles za intracytoplasmic hutokea katika seli za wanyama kama matokeo ya mkusanyiko wa maji katika saitoplazimu kutokana na kufurika kwa Ca2+ na maji53. Inashangaza kwamba utaratibu huu wa uharibifu wa seli unaweza kurekebishwa ikiwa uharibifu ni wa muda mfupi na seli huanza kuzalisha ATP kwa muda fulani, lakini ikiwa uharibifu unaendelea au kuwa mbaya zaidi, seli hufa.54 Uchunguzi wetu unaonyesha kwamba nematodes zilizotibiwa na 5-iodoindole haziwezi kurejesha biosynthesis ya kawaida baada ya kufidhiwa na hali ya mkazo.
Phenotype ya methylation inayotokana na 5-iodoindole katika B. xylophilus inaweza kuwa kutokana na kuwepo kwa iodini na usambazaji wake wa molekuli, kwa kuwa 7-iodoindole ilikuwa na athari ndogo ya kuzuia B. xylophilus kuliko 5-iodoindole (Jedwali 1 na Kielelezo cha Nyongeza S6). Matokeo haya yanalingana kwa kiasi na masomo ya Kimalta et al. (2014), ambaye aliripoti kwamba uhamishaji wa sehemu ya nitrojeni ya pyridyl katika indole kutoka para- hadi meta-position ilikomesha vacuolization, kizuizi cha ukuaji, na cytotoxicity katika seli za U251, na kupendekeza kwamba mwingiliano wa molekuli na tovuti maalum katika protini ni muhimu27,44,45. Mwingiliano kati ya indole indole au halojeni na vipokezi vya GluCL vilivyozingatiwa katika utafiti huu pia vinaunga mkono wazo hili, kwani 5- na 2-iodoindole zilipatikana kuwa na uhusiano na vipokezi vya GluCL kwa nguvu zaidi kuliko indoli zingine zilizochunguzwa (Mchoro 6 na Kielelezo cha Nyongeza S8). Iodini katika nafasi ya pili au ya tano ya indole ilipatikana kuungana na leucine 218 ya kipokezi cha GluCL kupitia vifungo vya hidrojeni ya uti wa mgongo, ambapo indole nyingine zenye halojeni na indole zenyewe hutengeneza vifungo hafifu vya hidrojeni vya upande na serine 260 (Mchoro 6). Kwa hivyo tunakisia kuwa ujanibishaji wa halojeni una jukumu muhimu katika uanzishaji wa kuzorota kwa vakuli, ilhali ufungaji mkali wa 5-iodoindole huweka chaneli ya ioni wazi, na hivyo kuruhusu kufurika kwa maji haraka na kupasuka kwa vakuli. Hata hivyo, utaratibu wa kina wa hatua ya 5-iodoindole inabakia kuamua.
Kabla ya matumizi ya vitendo ya 5-iodoindole, athari yake ya sumu kwenye mimea inapaswa kuchambuliwa. Majaribio yetu ya uotaji wa mbegu yalionyesha kuwa 5-iodoindole haikuwa na athari mbaya kwenye uotaji wa mbegu au michakato ya ukuzaji iliyofuata katika viwango vilivyosomwa (Mchoro 7). Kwa hivyo, utafiti huu unatoa msingi wa matumizi ya 5-iodoindole katika mazingira ya kiikolojia ili kudhibiti madhara ya nematodes ya pine kwa miti ya pine.
Ripoti za awali zimeonyesha kuwa tiba inayotegemea indole inawakilisha mbinu inayoweza kushughulikia tatizo la ukinzani wa viuavijasumu na kuendelea kwa saratani55. Kwa kuongezea, indoles huwa na shughuli za antibacterial, anticancer, antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, antiviral, antiproliferative na antituberculosis na zinaweza kutumika kama msingi mzuri wa ukuzaji wa dawa56,57. Utafiti huu unapendekeza kwa mara ya kwanza uwezekano wa matumizi ya iodini kama wakala wa antiparasitic na anthelmintic.
Avermectin iligunduliwa miongo mitatu iliyopita na kushinda Tuzo ya Nobel mnamo 2015, na matumizi yake kama dawa ya kutuliza maumivu bado yanaendelea kikamilifu. Hata hivyo, kutokana na maendeleo ya haraka ya upinzani dhidi ya avermectins katika nematodes na wadudu wadudu, mkakati mbadala, wa gharama nafuu na wa kirafiki unahitajika ili kudhibiti maambukizi ya PWN katika miti ya pine. Utafiti huu pia unaripoti utaratibu ambao 5-iodoindole huua nematode za pine na kwamba 5-iodoindole ina sumu ya chini kwa seli za mimea, ambayo hufungua matarajio mazuri kwa matumizi yake ya kibiashara ya baadaye.
Majaribio yote yaliidhinishwa na Kamati ya Maadili ya Chuo Kikuu cha Yeungnam, Gyeongsan, Korea, na mbinu zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya Kamati ya Maadili ya Chuo Kikuu cha Yeungnam.
Majaribio ya incubation ya yai yalifanyika kwa kutumia taratibu zilizowekwa43. Ili kutathmini viwango vya kuanguliwa (HR), nematodi waliokomaa wenye umri wa siku 1 (takriban majike 100 na madume 100) walihamishiwa kwenye sahani za Petri zenye kuvu na kuruhusiwa kukua kwa saa 24. Mayai basi yalitengwa na kutibiwa kwa 5-iodoindole (0.05 mM na 0.1 mm) au avermectin (10 μg/ml) kama kusimamishwa katika maji tasa distilled. Viahirisho hivi (500 μl; takriban mayai 100) vilihamishiwa kwenye visima vya sahani ya tishu zenye visima 24 na kuangaziwa kwa 22 °C. Hesabu za L2 zilifanywa baada ya saa 24 za incubation lakini zilichukuliwa kuwa zimekufa ikiwa seli hazikusogea wakati zilichochewa na waya laini ya platinamu. Jaribio hili lilifanyika katika hatua mbili, kila moja ikiwa na marudio sita. Data kutoka kwa majaribio yote mawili iliunganishwa na kuwasilishwa. Asilimia ya HR imehesabiwa kama ifuatavyo:
Vifo vya mabuu vilitathminiwa kwa kutumia taratibu zilizotengenezwa hapo awali. Mayai ya nematode yalikusanywa na viini-tete vilioanishwa kwa kuanguliwa katika maji yaliyosafishwa ili kutoa mabuu ya hatua ya L2. Mabuu yaliyosawazishwa (takriban 500 nematodes) yalitibiwa na 5-iodoindole (0.05 mM na 0.1 mM) au avermectin (10 μg/ml) na kukuzwa kwenye sahani za B. cinerea Petri. Baada ya saa 48 za incubation ifikapo 22 °C, nematodi zilikusanywa katika maji tasa distilled na kuchunguzwa kwa uwepo wa L2, L3, na L4 hatua. Uwepo wa hatua za L3 na L4 ulionyesha mabadiliko ya mabuu, ambapo uwepo wa hatua ya L2 haukuonyesha mabadiliko yoyote. Picha zilipatikana kwa kutumia Mfumo wa Upigaji Picha wa Seli Dijitali wa iRiS™. Jaribio hili lilifanyika katika hatua mbili, kila moja ikiwa na marudio sita. Data kutoka kwa majaribio yote mawili iliunganishwa na kuwasilishwa.
Sumu ya 5-iodoindole na avermectin kwa mbegu ilitathminiwa kwa kutumia vipimo vya kuota kwenye sahani za Murashige na Skoog agar.62 B. oleracea na R. raphanistrum mbegu zililowekwa kwa mara ya kwanza katika maji tasa ya distilled kwa siku moja, kuoshwa kwa 1 ml 100% sterilized 5% ethanol ya kibiashara hipokloriti) kwa dakika 15, na kuosha mara tano na 1 ml ya maji tasa. Kisha mbegu hizo zilibanwa kwenye sahani za agar za kuota zenye 0.86 g/l (0.2X) Murashige na Skoog kati na 0.7% ya agar ya bakteria na au bila 5-iodoindole au avermectin. Sahani hizo ziliwekwa ndani ya 22 ° C, na picha zilichukuliwa baada ya siku 3 za incubation. Jaribio hili lilifanyika katika hatua mbili, ambayo kila moja ilikuwa na marudio sita.
Muda wa kutuma: Feb-26-2025