Ukuaji wa shina apical meristem (SAM) ni muhimu kwa usanifu wa shina. Homoni za mimeagibberellins(GAs) hutekeleza majukumu muhimu katika kuratibu ukuaji wa mimea, lakini jukumu lao katika SAM bado halijaeleweka vizuri. Hapa, tulitengeneza kihisia kibiolojia cha ratiometriki cha uashiriaji wa GA kwa kutengeneza protini ya DELLA ili kukandamiza utendaji wake muhimu wa udhibiti katika majibu ya unukuzi wa GA huku tukihifadhi uharibifu wake juu ya utambuzi wa GA. Tunaonyesha kuwa kihisia hiki chenye msingi wa uharibifu hurekodi kwa usahihi mabadiliko katika viwango vya GA na hisi za seli wakati wa uundaji. Tulitumia biosensor hii kuweka ramani ya shughuli za kuashiria GA katika SAM. Tunaonyesha kuwa mawimbi ya juu ya GA yanapatikana hasa katika seli zilizo katikati ya organ primordia, ambazo ni vitangulizi vya seli za internodi. Kwa kutumia mbinu za faida na hasara-za-kazi, tunaonyesha zaidi kwamba GA inadhibiti uelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli, kuanzisha shirika la kisheria la seli za internodi, na hivyo kukuza vipimo vya internodi katika SAM.
The shoot apical meristem (SAM), iliyoko kwenye kilele cha chipukizi, ina sehemu ya seli shina ambazo shughuli zake huzalisha viungo vya kando na nodi za shina kwa njia ya kawaida na ya kurudiarudia katika maisha yote ya mmea. Kila moja ya vitengo hivi vinavyojirudia, au vifundo vya mimea, hujumuisha viunga na viungo vya kando kwenye vifundo, na mirija kwapa katika mhimili wa majani1. Ukuaji na shirika la nodi za mimea hubadilika wakati wa maendeleo. Katika Arabidopsis, ukuaji wa internodal hukandamizwa wakati wa hatua ya mimea, na meristems ya axillary hubakia katika axils ya majani ya rosette. Wakati wa mpito kwa awamu ya maua, SAM inakuwa meristem ya inflorescence, ikitoa internodes ndefu na buds kwapa, matawi katika axils ya majani ya cauline, na baadaye, maua yasiyo na majani2. Ingawa tumefanya maendeleo makubwa katika kuelewa taratibu zinazodhibiti uanzishwaji wa majani, maua, na matawi, ni kidogo sana inayojulikana kuhusu jinsi internodes hutokea.
Kuelewa usambazaji wa anga wa GAs utasaidia kuelewa vyema kazi za homoni hizi katika tishu tofauti na katika hatua tofauti za maendeleo. Taswira ya uharibifu wa mchanganyiko wa RGA-GFP ulioonyeshwa chini ya hatua ya mtangazaji wake mwenyewe hutoa taarifa muhimu juu ya udhibiti wa viwango vya GA jumla katika mizizi15,16. Walakini, usemi wa RGA hutofautiana katika tishu17 na umewekwa na GA18. Kwa hivyo, usemi tofauti wa mkuzaji wa RGA unaweza kusababisha muundo wa fluorescence unaozingatiwa na RGA-GFP na kwa hivyo njia hii sio ya kiasi. Hivi majuzi zaidi, bioactive fluorescein (Fl)-yenye lebo GA19,20 ilifunua mkusanyiko wa GA katika endocortex ya mizizi na udhibiti wa viwango vyake vya seli na usafiri wa GA. Hivi majuzi, kitambuzi cha GA FRET nlsGPS1 kilionyesha kuwa viwango vya GA vinahusiana na urefu wa seli katika mizizi, nyuzinyuzi, na hypocotyls zilizokua giza21. Walakini, kama tulivyoona, ukolezi wa GA sio kigezo pekee kinachodhibiti shughuli za kuashiria GA, kwani inategemea michakato ngumu ya kuhisi. Hapa, tukizingatia uelewa wetu wa njia za kuashiria za DELLA na GA, tunaripoti ukuzaji na uainishaji wa sensa ya kibayometriki inayotokana na uharibifu kwa ajili ya kuashiria GA. Ili kutengeneza kihisia hiki cha upimaji wa kibayolojia, tulitumia RGA inayobadilika-badilika ambayo inanyeti GA ambayo iliunganishwa kwenye protini ya umeme na kuonyeshwa kila mahali kwenye tishu, na vile vile protini ya umeme isiyohisi GA. Tunaonyesha kwamba michanganyiko ya protini ya RGA inayobadilika haiingiliani na utoaji wa ishara wa GA asilia inapoonyeshwa kila mahali, na kwamba kihisia kibiolojia hiki kinaweza kukadiria shughuli za kuashiria zinazotokana na uingizaji wa GA na uchakataji wa mawimbi ya GA kwa kifaa cha kuhisi chenye mwonekano wa juu wa angavu. Tulitumia biosensor hii kuweka ramani ya usambazaji wa anga ya muda wa shughuli ya kuashiria GA na kubainisha jinsi GA hudhibiti tabia za seli kwenye epidermis ya SAM. Tunaonyesha kwamba GA inadhibiti mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko ya seli za SAM zilizo kati ya primordia ya chombo, na hivyo kufafanua shirika la kisanduku la kisheria la internodi.
Hatimaye, tuliuliza ikiwa qmRGA inaweza kuripoti mabadiliko katika viwango vya asili vya GA kwa kutumia hypocotyl zinazokua. Hapo awali tulionyesha kuwa nitrati huchochea ukuaji kwa kuongeza usanisi wa GA na, kwa upande wake, uharibifu wa DELLA34. Ipasavyo, tuliona kwamba urefu wa hypocotyl katika pUBQ10::qmRGA miche iliyokuzwa chini ya ugavi mwingi wa nitrate (10 mm NO3-) ulikuwa mrefu zaidi kuliko ile ya miche iliyokuzwa chini ya hali ya upungufu wa nitrati (Mchoro wa Nyongeza 6a). Sambamba na mwitikio wa ukuaji, mawimbi ya GA yalikuwa ya juu zaidi katika hypocotyls ya miche iliyokuzwa chini ya hali ya 10 mm NO3 - kuliko katika miche iliyokuzwa bila nitrati (Mchoro wa Nyongeza 6b, c). Kwa hivyo, qmRGA pia huwezesha ufuatiliaji wa mabadiliko katika uwekaji saini wa GA yanayotokana na mabadiliko ya asili katika mkusanyiko wa GA.
Ili kuelewa ikiwa shughuli ya kuashiria GA inayotambuliwa na qmRGA inategemea mkusanyiko wa GA na mtazamo wa GA, kama inavyotarajiwa kulingana na muundo wa vitambuzi, tulichanganua usemi wa vipokezi vitatu vya GID1 katika tishu za mimea na uzazi. Katika miche, mstari wa mwandishi wa GID1-GUS ulionyesha kuwa GID1a na c zilionyeshwa sana katika cotyledons (Mchoro 3a-c). Kwa kuongeza, vipokezi vyote vitatu vilionyeshwa kwenye majani, primordia ya mizizi ya upande, vidokezo vya mizizi (isipokuwa kwa kifuniko cha mizizi ya GID1b), na mfumo wa mishipa (Mchoro 3a-c). Katika SAM ya inflorescence, tuligundua ishara za GUS tu kwa GID1b na 1c (Mchoro wa ziada 7a-c). In situ mseto alithibitisha mifumo hii kujieleza na zaidi alionyesha kuwa GID1c ilikuwa enhetligt walionyesha katika viwango vya chini katika SAM, ambapo GID1b ilionyesha kujieleza juu katika pembezoni mwa SAM (Supplementary Mtini. 7d-l). Muunganisho wa tafsiri wa pGID1b::2xmTQ2-GID1b pia ulifichua safu ya viwango vya usemi wa GID1b, kutoka usemi wa chini au usio na chochote katikati ya SAM hadi usemi wa juu kwenye mipaka ya viungo (Mchoro wa Nyongeza. 7m). Kwa hivyo, vipokezi vya GID1 havijasambazwa kwa usawa kote na ndani ya tishu. Katika majaribio yaliyofuata, tuliona pia kwamba kujieleza kupita kiasi kwa GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) kuliongeza unyeti wa qmRGA katika hypocotyls kwa matumizi ya GA ya nje (Mchoro 3d, e). Kwa kulinganisha, fluorescence kipimo na qd17mRGA katika hypocotyl ilikuwa insensitive kwa GA3 matibabu (Mtini. 3f, g). Kwa majaribio yote mawili, miche ilitibiwa kwa viwango vya juu vya GA (100 μM GA3) ili kutathmini tabia ya haraka ya kitambuzi, ambapo uwezo wa kushikamana na kipokezi cha GID1 uliimarishwa au kupotea. Kwa pamoja, matokeo haya yanathibitisha kuwa qmRGA biosensor hufanya kazi iliyojumuishwa kama kihisi cha GA na GA, na kupendekeza kuwa usemi tofauti wa kipokezi cha GID1 unaweza kurekebisha kwa kiasi kikubwa uwezo wa kutoa moshi wa kitambuzi.
Hadi sasa, usambazaji wa ishara za GA katika SAM bado haujulikani. Kwa hiyo, tulitumia mimea inayoonyesha qmRGA na pCLV3::mCherry-NLS ripota wa seli shina35 kukokotoa ramani za kiasi cha azimio la juu za shughuli ya kuashiria GA, tukizingatia safu ya L1 (epidermis; Kielelezo 4a, b, angalia Mbinu na Mbinu za Ziada), kwa kuwa L3 ina jukumu muhimu la ukuaji wa SAM. Hapa, pCLV3:: usemi wa mCherry-NLS umetoa marejeleo ya uhakika ya kijiometri kwa ajili ya kuchanganua usambazaji wa anga wa shughuli za kuashiria GA37. Ijapokuwa GA inachukuliwa kuwa muhimu kwa maendeleo ya chombo cha upande4, tuliona kuwa ishara za GA zilikuwa chini katika primordium ya maua (P) kuanzia hatua ya P3 (Mchoro 4a, b), ambapo P1 na P2 primodiums vijana walikuwa na shughuli za wastani sawa na katika eneo la kati (Mchoro 4a, b). Shughuli ya juu ya kuashiria GA iligunduliwa kwenye mipaka ya primordia ya chombo, kuanzia P1/P2 (kwenye kando ya mpaka) na kufikia kilele cha P4, na pia katika seli zote za eneo la pembeni ziko kati ya primordia (Mchoro 4a, b na Mchoro wa Nyongeza 8a, b). Shughuli hii ya juu ya kuashiria GA haikuzingatiwa tu kwenye epidermis lakini pia katika tabaka za L2 na L3 za juu (Mchoro wa ziada wa 8b). Muundo wa mawimbi ya GA uliogunduliwa katika SAM kwa kutumia qmRGA pia ulibaki bila kubadilika baada ya muda (Mchoro wa Nyongeza 8c–f, k). Ingawa muundo wa qd17mRGA ulidhibitiwa kwa utaratibu katika SAM ya mimea ya T3 kutoka kwa mistari mitano huru ambayo tulibainisha kwa kina, tuliweza kuchanganua ruwaza za umeme zilizopatikana kwa muundo wa pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Mchoro wa Nyongeza 8g–j, l). Katika mstari huu wa udhibiti, mabadiliko madogo tu katika uwiano wa fluorescence yaligunduliwa katika SAM, lakini katika kituo cha SAM tuliona kupungua kwa wazi na bila kutarajiwa kwa VENUS inayohusishwa na TagBFP. Hii inathibitisha kwamba muundo wa kuashiria unaozingatiwa na qmRGA unaonyesha uharibifu unaotegemea GA wa mRGA-VENUS, lakini pia inaonyesha kuwa qmRGA inaweza kukadiria kupita kiasi shughuli ya kuashiria GA katika kituo cha meristem. Kwa muhtasari, matokeo yetu yanaonyesha muundo wa kuashiria GA ambao kimsingi unaonyesha usambazaji wa primordia. Usambazaji huu wa kanda ya kati-primordial (IPR) ni kutokana na uanzishwaji wa taratibu wa shughuli za juu za GA za kuashiria kati ya primordium zinazoendelea na kanda ya kati, wakati huo huo shughuli za kuashiria GA katika primodium hupungua (Mchoro 4c, d).
Usambazaji wa vipokezi vya GID1b na GID1c (tazama hapo juu) unapendekeza kuwa usemi tofauti wa vipokezi vya GA husaidia kutengeneza muundo wa shughuli za kuashiria GA katika SAM. Tulijiuliza ikiwa mkusanyiko tofauti wa GA unaweza kuhusika. Ili kuchunguza uwezekano huu, tulitumia kihisi cha nlsGPS1 GA FRET21. Ongezeko la marudio ya kuwezesha liligunduliwa katika SAM ya nlsGPS1 iliyotibiwa kwa 10 μM GA4+7 kwa dakika 100 (Mchoro wa Nyongeza 9a–e), ikionyesha kuwa nlsGPS1 hujibu mabadiliko katika mkusanyiko wa GA katika SAM, kama inavyofanya katika mizizi21. Usambazaji wa anga wa masafa ya kuwezesha nlsGPS1 ulifunua viwango vya chini vya GA katika tabaka za nje za SAM, lakini ilionyesha kuwa viliinuliwa katikati na kwenye mipaka ya SAM (Mchoro 4e na Mchoro wa Nyongeza 9a,c). Hii inapendekeza kwamba GA pia inasambazwa katika SAM kwa muundo wa anga unaolingana na ule uliofichuliwa na qmRGA. Kama mbinu inayosaidia, pia tulishughulikia SAM kwa GA ya umeme (GA3-, GA4-, GA7-Fl) au Fl pekee kama udhibiti hasi. Ishara ya Fl ilisambazwa kote katika SAM, ikijumuisha eneo la kati na primodium, ingawa kwa kiwango cha chini (Mchoro 4j na Mchoro wa Nyongeza. 10d). Kinyume chake, GA-Fl zote tatu zilikusanywa mahsusi ndani ya mipaka ya awali na kwa viwango tofauti katika sehemu nyingine ya IPR, huku GA7-Fl ikijikusanya katika kikoa kikubwa zaidi katika IPR (Mchoro 4k na Kielelezo cha Nyongeza 10a,b). Ukadiriaji wa kiwango cha fluorescence ulibaini kuwa uwiano wa IPR na usio wa IPR ulikuwa wa juu zaidi katika SAM iliyotibiwa na GA-Fl ikilinganishwa na SAM iliyotibiwa na Fl (Mchoro 4 na Kielelezo cha 10c cha Nyongeza). Kwa pamoja, matokeo haya yanapendekeza kuwa GA iko katika viwango vya juu katika seli za IPR ambazo ziko karibu na mpaka wa chombo. Hii inapendekeza kwamba muundo wa shughuli ya kuashiria SAM GA unatokana na usemi tofauti wa vipokezi vya GA na mkusanyiko tofauti wa GA katika seli za IPR karibu na mipaka ya viungo. Kwa hivyo, uchambuzi wetu ulifunua muundo wa anga usiotarajiwa wa ishara za GA, na shughuli za chini katikati na primordium ya SAM na shughuli za juu katika IPR katika eneo la pembeni.
Ili kuelewa dhima ya shughuli tofauti za kuashiria GA katika SAM, tulichanganua uwiano kati ya shughuli ya kuashiria GA, upanuzi wa seli, na mgawanyiko wa seli kwa kutumia taswira ya muda halisi ya SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Kwa kuzingatia jukumu la GA katika udhibiti wa ukuaji, uwiano mzuri na vigezo vya upanuzi wa seli ulitarajiwa. Kwa hiyo, tulilinganisha kwanza ramani za shughuli za kuashiria GA na ramani za kiwango cha ukuaji wa uso wa seli (kama wakala wa nguvu ya upanuzi wa seli kwa seli fulani na kwa seli binti katika mgawanyiko) na ramani za anisotropy ya ukuaji, ambayo hupima mwelekeo wa upanuzi wa seli (pia hutumiwa hapa kwa seli fulani na kwa seli za binti katika mgawanyiko; Mtini. 5a,b, angalia Mbinu na Mbinu za Nyongeza). Ramani zetu za kiwango cha ukuaji wa seli za SAM zinalingana na uchunguzi wa awali38,39, na viwango vidogo vya ukuaji kwenye mpaka na viwango vya juu vya ukuaji katika kukuza maua (Mchoro 5a). Uchambuzi wa sehemu kuu (PCA) ulionyesha kuwa shughuli ya kuashiria GA ilihusishwa vibaya na kiwango cha ukuaji wa uso wa seli (Mchoro 5c). Pia tulionyesha kuwa axes kuu za tofauti, ikiwa ni pamoja na pembejeo za kuashiria GA na ukubwa wa ukuaji, zilikuwa za orthogonal kwa mwelekeo ulioamuliwa na usemi wa juu wa CLV3, kuthibitisha kutengwa kwa seli kutoka kwa kituo cha SAM katika uchanganuzi uliosalia. Uchunguzi wa uwiano wa Spearman ulithibitisha matokeo ya PCA (Kielelezo 5d), ikionyesha kuwa ishara za juu za GA katika IPR hazikusababisha upanuzi wa juu wa seli. Hata hivyo, uchanganuzi wa uunganisho ulifunua uwiano mzuri kidogo kati ya shughuli ya kuashiria GA na anisotropy ya ukuaji (Kielelezo 5c, d), na kupendekeza kuwa uwekaji ishara wa juu wa GA katika IPR huathiri mwelekeo wa ukuaji wa seli na ikiwezekana nafasi ya ndege ya mgawanyiko wa seli.
a, b Ramani za joto za wastani wa ukuaji wa uso (a) na ukuaji wa anisotropi (b) katika SAM wastani wa mimea saba inayojitegemea (hutumika kama viwakilishi vya nguvu na mwelekeo wa upanuzi wa seli, mtawalia). c Uchambuzi wa PCA ulijumuisha vigezo vifuatavyo: ishara ya GA, ukubwa wa ukuaji wa uso, anisotropy ya ukuaji wa uso, na usemi wa CLV3. Kipengele cha 1 cha PCA kilihusishwa haswa na ukubwa wa ukuaji wa uso na kuhusishwa vyema na ishara ya GA. Kipengele cha 2 cha PCA kilihusishwa hasa na anisotropi ya ukuaji wa uso na kuhusishwa vibaya na usemi wa CLV3. Asilimia inawakilisha utofauti unaoelezewa na kila sehemu. d Uchanganuzi wa uunganisho wa Spearman kati ya mawimbi ya GA, ukubwa wa ukuaji wa uso, na anisotropi ya ukuaji wa uso katika mizani ya tishu bila kujumuisha CZ. Nambari iliyo upande wa kulia ni thamani ya Spearman rho kati ya vigezo viwili. Nyota huonyesha hali ambapo uunganisho/uhusiano hasi ni muhimu sana. e Taswira ya 3D ya seli za Col-0 SAM L1 kwa kutumia hadubini iliyounganishwa. Kuta za seli mpya zilizoundwa katika SAM (lakini sio primodium) saa 10 hutiwa rangi kulingana na maadili yao ya pembe. Upau wa rangi unaonyeshwa kwenye kona ya chini ya kulia. Kipengele cha kuingiza kinaonyesha picha inayolingana ya 3D saa 0 h. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. f Viwanja vya sanduku vinaonyesha viwango vya mgawanyiko wa seli katika IPR na zisizo za IPR Col-0 SAM (n = mimea 10 inayojitegemea). Mstari wa kati unaonyesha wastani, na mipaka ya kisanduku inaonyesha asilimia ya 25 na 75. Whiskers zinaonyesha viwango vya chini na vya juu vilivyoamuliwa na programu ya R. Thamani za P zilipatikana kwa jaribio la Welch lenye mikia miwili. g, h Mchoro wa mpangilio unaoonyesha (g) jinsi ya kupima pembe ya ukuta wa seli mpya (magenta) kwa kuzingatia mwelekeo wa radial kutoka katikati ya SAM (mstari wa nukta nyeupe) (thamani za pembe za papo hapo pekee, yaani, 0–90°, zinazingatiwa), na (h) maelekezo ya mzingo/imara na radial ndani ya uhalali. i Histogramu za mara kwa mara za mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli kwenye SAM (bluu iliyokoza), IPR (bluu ya kati), na isiyo ya IPR (bluu nyepesi), mtawalia. Thamani za P zilipatikana kwa mtihani wa mikia miwili ya Kolmogorov-Smirnov. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. j Histogramu za mara kwa mara za mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli ya IPR karibu na P3 (kijani mwanga), P4 (kijani cha kati), na P5 (kijani giza), mtawalia. Thamani za P zilipatikana kwa mtihani wa mikia miwili ya Kolmogorov-Smirnov. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa.
Kwa hivyo, tulichunguza tena uhusiano kati ya uashiriaji wa GA na shughuli ya mgawanyiko wa seli kwa kutambua kuta mpya za seli wakati wa majaribio (Mchoro 5e). Njia hii ilituruhusu kupima mzunguko na mwelekeo wa mgawanyiko wa seli. Kwa kushangaza, tuligundua kwamba mzunguko wa mgawanyiko wa seli katika IPR na wengine wa SAM (yasiyo ya IPR, Kielelezo 5f) ilikuwa sawa, ikionyesha kuwa tofauti katika ishara za GA kati ya seli za IPR na zisizo za IPR haziathiri sana mgawanyiko wa seli. Hili, na uwiano mzuri kati ya uwekaji ishara wa GA na anisotropy ya ukuaji, ulitusukuma kuzingatia ikiwa shughuli ya kuashiria GA inaweza kuathiri uelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli. Tulipima mwelekeo wa ukuta wa seli mpya kama pembe ya papo hapo inayohusiana na mhimili wa radial unaounganisha kituo cha meristem na katikati ya ukuta wa seli mpya (Mchoro 5e-i) na tukaona mwelekeo wazi wa seli kugawanyika kwa pembe zilizo karibu na 90 ° ikilinganishwa na mhimili wa radial, na masafa ya juu zaidi yaliyozingatiwa katika 70-80-60 ° na 2% (2%). (Mchoro 5e, i), sambamba na mgawanyiko wa seli katika mwelekeo wa mzunguko / transverse (Mchoro 5h). Ili kuchunguza mchango wa uashiriaji wa GA kwa tabia hii ya mgawanyiko wa seli, tulichanganua vigezo vya mgawanyiko wa seli katika IPR na zisizo za IPR kando (Mchoro 5i). Tuliona kwamba mgawanyiko wa pembe ya mgawanyiko katika seli za IPR ulitofautiana na ule wa seli zisizo za IPR au katika seli katika SAM nzima, na seli za IPR zinaonyesha sehemu kubwa ya mgawanyiko wa seli za kando/mviringo, yaani, 70–80° na 80–90° (33.86% na 30.71%, mtawalia, uwiano unaolingana 5). Kwa hivyo, uchunguzi wetu ulifunua uhusiano kati ya ishara ya juu ya GA na mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli karibu na mwelekeo wa mzunguko, sawa na uwiano kati ya shughuli za kuashiria GA na anisotropy ya ukuaji (Mchoro 5c, d). Ili kuanzisha zaidi uhifadhi wa anga wa chama hiki, tulipima mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko katika seli za IPR zinazozunguka primordium kuanzia P3, kwa kuwa shughuli ya juu ya GA ya kuashiria iligunduliwa katika eneo hili kuanzia P4 (Mchoro 4). Pembe za mgawanyiko wa IPR karibu na P3 na P4 hazikuonyesha tofauti kubwa za kitakwimu, ingawa ongezeko la mzunguko wa mgawanyiko wa seli za pembeni lilizingatiwa katika IPR karibu na P4 (Mchoro 5j). Hata hivyo, katika seli za IPR karibu na P5, tofauti katika mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli ikawa muhimu kwa takwimu, na ongezeko kubwa la mzunguko wa mgawanyiko wa seli za transverse (Mchoro 5j). Kwa pamoja, matokeo haya yanapendekeza kuwa uwekaji ishara wa GA unaweza kudhibiti uelekeo wa mgawanyiko wa seli katika SAM, ambayo inalingana na ripoti za awali40,41 kwamba uwekaji ishara wa juu wa GA unaweza kushawishi uelekeo wa kando wa mgawanyiko wa seli katika IPR.
Inatabiriwa kuwa seli katika IPR hazitajumuishwa katika primordia bali katika internodes2,42,43. Mwelekeo wa mpito wa mgawanyiko wa seli katika IPR unaweza kusababisha mpangilio wa kawaida wa safu za longitudinal sambamba za seli za epidermal katika internodi. Uchunguzi wetu uliofafanuliwa hapo juu unapendekeza kwamba uwekaji saini wa GA huenda una jukumu katika mchakato huu kwa kudhibiti mwelekeo wa mgawanyiko wa seli.
Kupoteza utendakazi wa jeni kadhaa za DELLA husababisha mwitikio wa GA, na della mutants inaweza kutumika kujaribu nadharia hii44. Kwanza tulichanganua ruwaza za usemi za jeni tano za DELLA katika SAM. Muunganisho wa maandishi ya laini ya GUS45 ulibaini kuwa GAI, RGA, RGL1, na RGL2 (kwa kiasi kidogo) zilionyeshwa kwenye SAM (Mchoro wa Nyongeza 11a-d). Katika situ mseto zaidi alionyesha kuwa Gai mRNA hujilimbikiza hasa katika primordia na kuendeleza maua (Supplementary Mtini. 11e). RGL1 na RGL3 mRNA ziligunduliwa kote kwenye kanopi ya SAM na katika maua ya zamani, ambapo RGL2 mRNA ilikuwa nyingi zaidi katika eneo la mpaka (Mchoro wa Nyongeza 11f–h). Upigaji picha wa pRGL3::RGL3-GFP SAM ulithibitisha usemi unaozingatiwa na mseto wa in situ na ulionyesha kuwa protini ya RGL3 hujilimbikiza katika sehemu ya kati ya SAM (Mchoro wa Nyongeza 11i). Kwa kutumia mstari wa pRGA::GFP-RGA, pia tuligundua kuwa protini ya RGA hujilimbikiza kwenye SAM, lakini wingi wake hupungua kwenye mpaka kuanzia P4 (Mchoro wa Nyongeza. 11j). Hasa, mifumo ya kujieleza ya RGL3 na RGA inalingana na shughuli ya juu ya kuashiria GA katika IPR, kama inavyotambuliwa na qmRGA (Mchoro 4). Zaidi ya hayo, data hizi zinaonyesha kuwa DELLA zote zimeonyeshwa kwenye SAM na kwamba usemi wao kwa pamoja unahusisha SAM nzima.
Baadaye tulichambua vigezo vya mgawanyiko wa seli katika SAM ya aina ya mwitu (Ler, control) na gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (kimataifa) mutants (Mchoro 6a, b). Jambo la kufurahisha, tuliona mabadiliko makubwa ya kitakwimu katika usambazaji wa masafa ya pembe ya mgawanyiko wa seli katika della global mutant SAM ikilinganishwa na aina ya pori (Mchoro 6c). Mabadiliko haya katika della global mutant yalitokana na ongezeko la mzunguko wa 80-90 ° (34.71% dhidi ya 24.55%) na, kwa kiasi kidogo, 70-80 ° angles (23.78% dhidi ya 20.18%), yaani, sambamba na mgawanyiko wa seli transverse (Mchoro 6c). Mzunguko wa mgawanyiko usio na transverse (0-60 °) pia ulikuwa chini katika della global mutant (Mchoro 6c). Mzunguko wa mgawanyiko wa seli za transverse uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika SAM ya della global mutant (Mchoro 6b). Mzunguko wa mgawanyiko wa seli katika IPR pia ulikuwa wa juu zaidi katika della global mutant ikilinganishwa na aina ya mwitu (Mchoro 6d). Nje ya eneo la IPR, aina ya mwitu ilikuwa na mgawanyo sawa zaidi wa pembe za mgawanyiko wa seli, ambapo della global mutant ilipendelea mgawanyiko wa tangential kama IPR (Mchoro 6e). Pia tulikadiria uelekeo wa mgawanyiko wa seli katika SAM ya ga2 oxidase (ga2ox) mutants quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, na ga2ox6-2), mandharinyuma ya GA-isiyotumika ambayo GA hujilimbikiza. Sambamba na ongezeko la viwango vya GA, SAM ya inflorescence ya quintuple ga2ox mutant ilikuwa kubwa kuliko ile ya Col-0 (Mchoro wa Nyongeza 12a, b), na ikilinganishwa na Col-0, quintuple ga2ox SAM ilionyesha usambazaji tofauti kabisa wa pembe za mgawanyiko wa seli, na frequency ya pembe ikiongezeka kutoka 050, ° ya kugawanya tena kwa 9. Kielelezo 12a-c). Kwa hivyo, tunaonyesha kuwa uanzishaji msingi wa uwekaji ishara wa GA na mkusanyiko wa GA huleta mgawanyiko wa seli katika IPR na SAM zingine.
a, b taswira ya 3D ya safu ya L1 ya Ler (a) iliyotiwa madoa ya PI na della mutant ya kimataifa (b) SAM kwa kutumia hadubini ya confocal. Kuta mpya za seli zilizoundwa katika SAM (lakini si primodium) katika kipindi cha 10-h huonyeshwa na kupakwa rangi kulingana na thamani za pembe zao. Kipengee kinaonyesha SAM saa 0 h. Upau wa rangi unaonyeshwa kwenye kona ya chini ya kulia. Mshale katika (b) unaelekeza kwenye mfano wa faili za seli zilizopangiliwa katika global della mutant. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. ce ulinganisho wa mzunguko wa usambazaji wa mwelekeo wa ndege wa mgawanyiko wa seli katika SAM nzima (d), IPR (e), na isiyo ya IPR (f) kati ya Ler na della ya kimataifa. Thamani za P zilipatikana kwa kutumia mtihani wa Kolmogorov-Smirnov wenye mikia miwili. f, g taswira ya 3D ya picha zilizounganishwa za SAM iliyochafuliwa na PI ya Col-0 (i) na pCUC2::gai-1-VENUS (j) mimea isiyobadilika. Paneli (a, b) zinaonyesha kuta mpya za seli (lakini si primordia) zilizoundwa katika SAM ndani ya saa 10. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. h–j Ulinganisho wa usambazaji wa mzunguko wa mwelekeo wa ndege wa mgawanyiko wa seli ulio katika SAM nzima (h), IPR (i) na zisizo za IPR (j) kati ya mimea ya Col-0 na pCUC2::gai-1-VENUS. Thamani za P zilipatikana kwa kutumia mtihani wa Kolmogorov-Smirnov wenye mikia miwili.
Kisha tulijaribu athari ya kuzuia uwekaji saini wa GA haswa katika IPR. Kufikia hili, tulitumia kikuzaji cha kikombe cha cotyledon 2 (CUC2) ili kuendesha usemi wa protini hasi ya gai-1 iliyounganishwa kwa VENUS (katika pCUC2::gai-1-VENUS line). Katika SAM ya aina ya mwitu, mkuzaji wa CUC2 huendesha usemi wa IPR nyingi katika SAM, ikijumuisha seli za mpaka, kutoka P4 na kuendelea, na usemi maalum sawa ulizingatiwa katika mimea ya pCUC2::gai-1-VENUS (tazama hapa chini). Usambazaji wa pembe za mgawanyiko wa seli kwenye SAM au IPR ya pCUC2:: mimea ya gai-1-VENUS haikuwa tofauti sana na ile ya aina ya mwitu, ingawa bila kutarajia tuligundua kwamba seli zisizo na IPR katika mimea hii zimegawanywa kwa mzunguko wa juu wa 80-90 ° (Mchoro 6f-j).
Imependekezwa kuwa mwelekeo wa mgawanyiko wa seli hutegemea jiometri ya SAM, hasa mkazo wa mkazo unaotokana na curvature ya tishu46. Kwa hivyo tuliuliza ikiwa umbo la SAM lilibadilishwa katika mimea ya della global mutant na pCUC2::gai-1-VENUS. Kama ilivyoripotiwa hapo awali12, saizi ya della global mutant SAM ilikuwa kubwa kuliko ile ya aina ya porini (Mchoro wa Nyongeza 13a, b, d). In situ mseto wa CLV3 na STM RNA ulithibitisha upanuzi wa meristem katika della mutants na kuonyesha zaidi upanuzi wa upande wa niche ya seli shina (Mchoro wa Nyongeza 13e, f, h, i). Hata hivyo, curvature ya SAM ilikuwa sawa katika genotypes zote mbili (Mchoro wa ziada 13k, m, n, p). Tuliona ongezeko sawa la ukubwa katika gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant bila mabadiliko ya curvature ikilinganishwa na aina ya mwitu (Mchoro wa ziada 13c, d, g, j, l, o, p). Mzunguko wa mwelekeo wa mgawanyiko wa seli pia uliathiriwa katika della quadruple mutant, lakini kwa kiasi kidogo kuliko katika della monolithic mutant (Mchoro wa ziada wa 12d-f). Athari hii ya kipimo, pamoja na ukosefu wa athari kwenye curvature, inapendekeza kwamba shughuli iliyobaki ya RGL3 katika Della quadruple mutant inapunguza mabadiliko katika mwelekeo wa mgawanyiko wa seli unaosababishwa na kupoteza kwa shughuli za DELLA na kwamba mabadiliko katika mgawanyiko wa seli za kando hutokea kutokana na mabadiliko katika shughuli za kuashiria GA badala ya mabadiliko katika jiometri ya SAM. Kama ilivyoelezwa hapo juu, mkuzaji wa CUC2 anaendesha usemi wa IPR katika SAM kuanzia P4 (Mchoro wa Nyongeza 14a, b), na kinyume chake, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ilikuwa na ukubwa mdogo lakini mzingo wa juu zaidi (Mchoro wa Nyongeza 14c-h). Mabadiliko haya katika mofolojia ya pCUC2::gai-1-VENUS SAM yanaweza kusababisha usambazaji tofauti wa mikazo ya kimitambo ikilinganishwa na aina ya mwitu, ambapo mikazo ya juu ya mzingo huanza kwa umbali mfupi kutoka kituo cha SAM47. Vinginevyo, mabadiliko katika mofolojia ya pCUC2::gai-1-VENUS SAM yanaweza kutokana na mabadiliko ya sifa za mitambo za kikanda zinazochochewa na msemo wa transgene48. Katika visa vyote viwili, hii inaweza kupunguza kwa kiasi athari za mabadiliko katika uwekaji saini wa GA kwa kuongeza uwezekano kwamba seli zitagawanyika katika uelekeo wa mzingo/mvuto, kufafanua uchunguzi wetu.
Kwa pamoja, data yetu inathibitisha kuwa uwekaji wa mawimbi wa juu zaidi wa GA una jukumu kubwa katika uelekeo wa kando wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika IPR. Pia zinaonyesha kuwa mkunjo wa meristem pia huathiri uelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika IPR.
Mwelekeo wa mpito wa ndege ya mgawanyiko katika IPR, kutokana na shughuli ya juu ya kuashiria GA, unapendekeza kwamba GA hupanga awali faili ya seli ya radial katika epidermis ndani ya SAM ili kufafanua shirika la seli ambayo baadaye itapatikana katika internode ya epidermal. Hakika, kama files kiini walikuwa mara kwa mara inayoonekana katika SAM picha ya della mutants kimataifa (Mtini. 6b). Kwa hivyo, ili kuchunguza zaidi kazi ya ukuzaji wa muundo wa anga wa kuashiria GA katika SAM, tulitumia taswira ya muda kupita kuchambua shirika la anga la seli katika IPR katika aina ya mwitu (Ler na Col-0), della global mutants, na pCUC2::gai-1-VENUS mimea ya transgenic.
Tuligundua kuwa qmRGA ilionyesha kuwa shughuli ya kuashiria GA katika IPR iliongezeka kutoka P1/P2 na kufikia kilele cha P4, na muundo huu ulisalia thabiti baada ya muda (Mchoro 4a–f na Kielelezo cha Nyongeza 8c–f, k). Ili kuchanganua mpangilio wa anga wa seli katika IPR na ishara ya GA inayoongezeka, tuliandika seli za Ler IPR hapo juu na kwa pande za P4 kulingana na hatima yao ya maendeleo iliyochanganuliwa saa 34 baada ya uchunguzi wa kwanza, yaani, zaidi ya mara mbili za plastid, zinazoturuhusu kufuata seli za IPR wakati wa maendeleo ya awali kutoka P1/P2 hadi P4. Tulitumia rangi tatu tofauti: njano kwa seli hizo ambazo ziliunganishwa kwenye primodium karibu na P4, kijani kwa zile zilizokuwa kwenye IPR, na zambarau kwa wale walioshiriki katika michakato yote miwili (Mchoro 7a–c). Saa t0 (0 h), tabaka 1-2 za seli za IPR zilionekana mbele ya P4 (Mchoro 7a). Kama ilivyotarajiwa, wakati seli hizi ziligawanyika, zilifanya hivyo hasa kupitia ndege ya mgawanyiko wa transverse (Mchoro 7a-c). Matokeo sawa yalipatikana kwa kutumia Col-0 SAM (ikizingatia P3, ambayo mikunjo ya mpaka sawa na P4 katika Ler), ingawa katika genotype hii mkunjo ulioundwa kwenye mpaka wa maua ulificha seli za IPR haraka zaidi (Mchoro 7g-i). Kwa hivyo, muundo wa mgawanyiko wa seli za IPR hupanga mapema seli katika safu za radial, kama katika internodes. Mpangilio wa safu mionzi na ujanibishaji wa seli za IPR kati ya viungo vinavyofuatana unapendekeza kwamba seli hizi ni progenitors internodal.
Hapa, tulitengeneza kiboreshaji kiashiria cha ratiometriki cha GA, qmRGA, ambacho huruhusu upimaji wa kiasi wa shughuli za kuashiria GA zinazotokana na mkusanyiko wa vipokezi vya GA na GA huku tukipunguza kuingiliwa kwa njia za uashiriaji endogenous, na hivyo kutoa taarifa kuhusu utendaji kazi wa GA katika kiwango cha seli. Ili kufanya hivyo, tumeunda protini ya DELLA iliyorekebishwa, mRGA, ambayo imepoteza uwezo wa kuunganisha washirika wa mwingiliano wa DELLA lakini bado ni nyeti kwa proteolysis inayotokana na GA. qmRGA hujibu mabadiliko ya nje na ya asili katika viwango vya GA, na sifa zake za hisi za hisi huwezesha tathmini ya mabadiliko ya anga katika shughuli ya kuashiria GA wakati wa ukuzaji. qmRGA pia ni zana inayoweza kunyumbulika sana kwani inaweza kubadilishwa kwa tishu tofauti kwa kubadilisha kikuzaji kinachotumiwa kwa kujieleza (ikihitajika), na kwa kuzingatia hali iliyohifadhiwa ya njia ya kuashiria GA na motifu ya PFYRE kwenye angiospermu, kuna uwezekano wa kuhamishwa kwa spishi zingine22. Sambamba na hili, mabadiliko sawa katika protini ya SLR1 DELLA ya mchele (HYY497AAA) pia yalionyeshwa kukandamiza shughuli ya kikandamiza ukuaji ya SLR1 huku ikipunguza tu uharibifu wake unaotokana na GA, sawa na mRGA23. Hasa, tafiti za hivi majuzi katika Arabidopsis zilionyesha kuwa badiliko moja la asidi ya amino katika kikoa cha PFYRE (S474L) lilibadilisha shughuli ya unukuzi ya RGA bila kuathiri uwezo wake wa kuingiliana na washirika wa kipengele cha unukuzi50. Ingawa mabadiliko haya yanakaribiana sana na vibadala 3 vya asidi ya amino vilivyopo katika mRGA, tafiti zetu zinaonyesha kuwa mabadiliko haya mawili yanabadilisha sifa tofauti za DELLA. Ingawa washirika wengi wa kipengele cha unukuu hufungamana na vikoa vya LHR1 na SAW vya DELLA26,51, baadhi ya asidi za amino zilizohifadhiwa katika kikoa cha PFYRE zinaweza kusaidia kuleta uthabiti mwingiliano huu.
Ukuzaji wa Internode ni sifa kuu katika usanifu wa mimea na uboreshaji wa mavuno. qmRGA ilifichua shughuli ya juu ya kuashiria GA katika seli za progenitor za internodi za IPR. Kwa kuchanganya upigaji picha wa kiasi na jenetiki, tulionyesha kuwa mifumo ya kuashiria GA huweka zaidi ndege za mgawanyiko wa seli zenye mduara/mwembamba kwenye sehemu ya ngozi ya SAM, ikiunda shirika la mgawanyiko wa seli linalohitajika kwa ajili ya ukuzaji wa internodi. Vidhibiti kadhaa vya mwelekeo wa ndege wa mgawanyiko wa seli wametambuliwa wakati wa maendeleo52,53. Kazi yetu inatoa mfano wazi wa jinsi shughuli ya kuashiria GA inadhibiti kigezo hiki cha simu za mkononi. DELLA inaweza kuingiliana na muundo wa protini zilizotangulia41, kwa hivyo uwekaji saini wa GA unaweza kudhibiti mwelekeo wa ndege wa mgawanyiko wa seli kwa kuathiri moja kwa moja mwelekeo wa korotiko wa mikrotubu40,41,54,55. Tulionyesha bila kutarajia kwamba katika SAM, uhusiano wa shughuli ya juu ya kuashiria GA haikuwa urefu wa seli au mgawanyiko, lakini anisotropy ya ukuaji tu, ambayo inaambatana na athari ya moja kwa moja ya GA kwenye mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika IPR. Hata hivyo, hatuwezi kuwatenga kuwa athari hii inaweza pia kuwa isiyo ya moja kwa moja, kwa mfano iliyopatanishwa na ulainishaji wa ukuta wa seli unaotokana na GA56. Mabadiliko katika mali ya ukuta wa seli husababisha mkazo wa mitambo57,58, ambayo inaweza pia kuathiri mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli kwa kuathiri mwelekeo wa microtubules39,46,59. Madhara ya pamoja ya mkazo wa mitambo unaosababishwa na GA na udhibiti wa moja kwa moja wa mwelekeo wa mikrotubuli na GA inaweza kuhusishwa katika kuzalisha muundo maalum wa mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika IPR ili kufafanua internodes, na tafiti zaidi zinahitajika ili kupima wazo hili. Vile vile, tafiti za awali zimeonyesha umuhimu wa protini zinazoingiliana na DELLA TCP14 na 15 katika udhibiti wa uundaji wa internode60,61 na mambo haya yanaweza kupatanisha hatua ya GA pamoja na BREVIPEDICELLUS (BP) na PENNYWISE (PNY), ambayo inadhibiti maendeleo ya internode na imeonyeshwa, kushawishi 2 GA2. Kwa kuzingatia kwamba DELLA huingiliana na brassinosteroid, ethilini, asidi ya jasmoniki, na asidi abscisic (ABA) njia za kuashiria63,64 na kwamba homoni hizi zinaweza kuathiri mwelekeo wa mikrotubuli65, athari za GA kwenye mwelekeo wa mgawanyiko wa seli pia zinaweza kusuluhishwa na homoni zingine.
Uchunguzi wa awali wa cytological ulionyesha kuwa mikoa ya ndani na nje ya SAM ya Arabidopsis inahitajika kwa maendeleo ya internode2,42. Ukweli kwamba GA inadhibiti kikamilifu mgawanyiko wa seli katika tishu za ndani12 inasaidia kazi mbili ya GA katika kudhibiti ukubwa wa usawa na ukubwa wa internode katika SAM. Mchoro wa mgawanyiko wa seli unaoelekezwa pia unadhibitiwa kwa nguvu katika tishu za ndani za SAM, na udhibiti huu ni muhimu kwa ukuaji wa shina52. Itapendeza kuchunguza ikiwa GA pia ina jukumu la kuelekeza ndege ya mgawanyiko wa seli katika shirika la ndani la SAM, na hivyo kusawazisha vipimo na ukuzaji wa internodi ndani ya SAM.
Mimea ilikuzwa katika udongo au 1x Murashige-Skoog (MS) kati (Duchefa) iliyoongezewa 1% sucrose na 1% agar (Sigma) chini ya hali ya kawaida (mwanga wa saa 16, 22 °C), isipokuwa kwa majaribio ya hypocotyl na ukuaji wa mizizi ambayo miche ilikuzwa kwenye sahani za wima chini ya mwanga wa 22 ° C mara kwa mara. Kwa majaribio ya nitrate, mimea ilikuzwa kwenye MS medium iliyorekebishwa (kiwanda cha mimea cha bioWORLD) iliyoongezewa nitrati ya kutosha (0 au 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose na 1% A-agar (Sigma) chini ya hali ya siku ndefu.
GID1a cDNA iliyoingizwa katika pDONR221 iliunganishwa tena na pDONR P4-P1R-pUBQ10 na pDONR P2R-P3-mCherry ndani ya pB7m34GW ili kuzalisha pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA ya IDD2 iliyoingizwa kwenye pDONR221 iliunganishwa tena kuwa pB7RWG266 ili kutoa p35S:IDD2-RFP. Ili kuzalisha pGID1b::2xmTQ2-GID1b, kipande cha kb 3.9 juu ya mkondo wa eneo la usimbaji la GID1b na kipande cha kb 4.7 kilicho na GID1b cDNA (1.3 kb) na kiondoaji (kb 3.4) kwanza vilikuzwa kwa kutumia vianzio katika 3 Supplementary Table-PR4 (Thermo Fisher Scientific) na pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), mtawalia, na hatimaye kuunganishwa tena na pDONR221 2xmTQ268 kwenye vekta lengwa la pGreen 012567 kwa kutumia cloning ya Gateway. Ili kuzalisha pCUC2::LSSmOrange, mfuatano wa kikuzaji cha CUC2 (bp 3229 juu ya mkondo wa ATG) ukifuatwa na mfuatano wa usimbaji wa mOrange kubwa ya Stokes-shifted (LSSmOrange)69 yenye mawimbi ya ujanibishaji wa nyuklia ya N7 na kisimamisha unukuzi cha NOS viliunganishwa kwenye mfumo wa kulenga tena wa kibichi kwa kutumia p. (Invitrojeni). Vekta ya binary ya mmea ilianzishwa katika aina ya Agrobacterium tumefaciens GV3101 na kuletwa kwenye majani ya Nicotiana benthamiana kwa njia ya kupenyeza ya Agrobacterium na katika Arabidopsis thaliana Col-0 kwa njia ya dip ya maua, mtawalia. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry na pCLV3::mCherry-NLS qmRGA zilitengwa kutoka kwa vizazi vya F3 na F1 vya misalaba husika, mtawalia.
Mseto wa RNA in situ ulifanywa kwa takriban 1 cm urefu wa tips72, ambayo ilikusanywa na mara moja fasta katika FAA ufumbuzi (3.7% formaldehyde, 5% asidi asetiki, 50% ethanol) kabla ya kupozwa hadi 4 °C. Baada ya matibabu ya utupu kwa dakika 2 × 15, kirekebishaji kilibadilishwa na sampuli ziliwekwa ndani ya usiku mmoja. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, na cDNA za RGL3 na uchunguzi wa antisense kwa 3′-UTRs zao ziliunganishwa kwa kutumia vianzio vilivyoonyeshwa katika Jedwali la 3 la Nyongeza kama ilivyoelezwa na Rosier et al.73. Vichunguzi vilivyo na lebo ya Digoxigenin viligunduliwa kwa kutumia kingamwili za digoxigenin (dilution mara 3000; Roche, nambari ya katalogi: 11 093 274 910), na sehemu zilitiwa doa na 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfati (BCIP, 250-diumtralution)/lizoumtralution ya BT (BT) Suluhisho la dilution mara 200).
Muda wa kutuma: Feb-10-2025