Ukuaji wa meristem ya kilele cha shina (SAM) ni muhimu kwa usanifu wa shina.gibberellini(GA) zina jukumu muhimu katika kuratibu ukuaji wa mimea, lakini jukumu lao katika SAM bado halieleweki vizuri. Hapa, tulitengeneza kihisi cha kibiolojia cha uwiano wa ishara ya GA kwa kuibadilisha protini ya DELLA ili kukandamiza kazi yake muhimu ya udhibiti katika mwitikio wa unukuzi wa GA huku tukihifadhi uharibifu wake wakati wa utambuzi wa GA. Tunaonyesha kwamba kihisi hiki cha kibiolojia kinachotegemea uharibifu hurekodi kwa usahihi mabadiliko katika viwango vya GA na uhisi wa seli wakati wa maendeleo. Tulitumia kihisi hiki cha kibiolojia kuchora ramani ya shughuli ya ishara ya GA katika SAM. Tunaonyesha kwamba ishara za GA za juu zipo hasa katika seli zilizopo kati ya primordia ya viungo, ambazo ni vitangulizi vya seli za internode. Kwa kutumia mbinu za kupata na kupoteza utendaji, tunaonyesha zaidi kwamba GA hudhibiti mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli, na kuanzisha mpangilio wa seli za internode, na hivyo kukuza vipimo vya internode katika SAM.
Meristem ya kilele cha shina (SAM), iliyoko kwenye kilele cha shina, ina sehemu ya seli shina ambazo shughuli zake hutoa viungo vya pembeni na nodi za shina kwa njia ya kawaida na ya kurudiarudia katika maisha yote ya mmea. Kila moja ya vitengo hivi vinavyojirudia, au nodi za mmea, inajumuisha nodi za ndani na viungo vya pembeni kwenye nodi, na meristemu za kwapa kwenye kwapa za jani1. Ukuaji na mpangilio wa nodi za mmea hubadilika wakati wa ukuaji. Katika Arabidopsis, ukuaji wa ndani ya nodi hukandamizwa wakati wa hatua ya mimea, na meristemu za kwapa hubaki zimelala kwenye kwapa za majani ya rosette. Wakati wa mpito hadi awamu ya maua, SAM inakuwa meristem ya inflorescence, ikitoa internodes ndefu na chipukizi za kwapa, matawi kwenye kwapa za majani ya cauline, na baadaye, maua yasiyo na majani2. Ingawa tumefanya maendeleo makubwa katika kuelewa mifumo inayodhibiti uanzishaji wa majani, maua, na matawi, ni machache sana yanayojulikana kuhusu jinsi internodes zinavyotokea.
Kuelewa usambazaji wa GA wa anga na muda kutasaidia kuelewa vyema kazi za homoni hizi katika tishu tofauti na katika hatua tofauti za ukuaji. Taswira ya uharibifu wa muunganiko wa RGA-GFP unaoonyeshwa chini ya hatua ya kipandishi chake hutoa taarifa muhimu kuhusu udhibiti wa viwango vya jumla vya GA katika mizizi15,16. Hata hivyo, usemi wa RGA hutofautiana katika tishu17 na unadhibitiwa na GA18. Hivyo, usemi tofauti wa kipandishi cha RGA unaweza kusababisha muundo wa fluorescence unaoonekana na RGA-GFP na hivyo njia hii si ya kiasi. Hivi majuzi, GA19,20 yenye lebo ya kibiolojia ya fluorescein (Fl) ilifunua mkusanyiko wa GA katika endocortex ya mizizi na udhibiti wa viwango vyake vya seli kwa usafiri wa GA. Hivi majuzi, kihisi cha GA FRET nlsGPS1 kilionyesha kuwa viwango vya GA vinahusiana na urefu wa seli katika mizizi, nyuzi, na hypocotyls zilizokua nyeusi21. Hata hivyo, kama tulivyoona, mkusanyiko wa GA sio kigezo pekee kinachodhibiti shughuli ya ishara ya GA, kwani inategemea michakato tata ya kuhisi. Hapa, tukijenga uelewa wetu wa njia za kuashiria za DELLA na GA, tunaripoti maendeleo na uainishaji wa kihisi cha kibiolojia kinachotegemea uchakavu kwa ajili ya kuashiria GA. Ili kukuza kihisi hiki cha kibiolojia cha kiasi, tulitumia RGA nyeti ya GA iliyobadilishwa ambayo iliunganishwa na protini ya fluorescent na kuonyeshwa kila mahali katika tishu, pamoja na protini ya fluorescent isiyoathiriwa na GA. Tunaonyesha kwamba muunganiko wa protini ya RGA iliyobadilishwa hauingiliani na kuashiria kwa GA ya asili inapoonyeshwa kila mahali, na kwamba kihisi hiki cha kibiolojia kinaweza kupima shughuli za kuashiria zinazotokana na uingizaji wa GA na usindikaji wa ishara za GA na kifaa cha kuhisi chenye azimio kubwa la anga. Tulitumia kihisi hiki cha kibiolojia kuchora ramani ya usambazaji wa anga wa shughuli za kuashiria GA na kupima jinsi GA inavyodhibiti tabia ya seli katika epidermis ya SAM. Tunaonyesha kwamba GA inadhibiti mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli za SAM zilizopo kati ya primordia ya viungo, na hivyo kufafanua mpangilio wa seli za kisheria za internode.
Hatimaye, tuliuliza kama qmRGA inaweza kuripoti mabadiliko katika viwango vya GA vya asili kwa kutumia hypocotyls zinazokua. Hapo awali tulionyesha kuwa nitrati huchochea ukuaji kwa kuongeza usanisi wa GA na, kwa upande wake, uharibifu wa DELLA34. Kwa hivyo, tuliona kwamba urefu wa hypocotyl katika miche ya pUBQ10::qmRGA iliyopandwa chini ya usambazaji mwingi wa nitrati (10 mM NO3−) ulikuwa mrefu zaidi kuliko ule wa miche iliyopandwa chini ya hali ya upungufu wa nitrati (Mchoro wa Nyongeza 6a). Sambamba na mwitikio wa ukuaji, ishara za GA zilikuwa juu zaidi katika hypocotyls za miche iliyopandwa chini ya hali ya 10 mM NO3− kuliko katika miche iliyopandwa bila nitrati (Mchoro wa Nyongeza 6b, c). Hivyo, qmRGA pia huwezesha ufuatiliaji wa mabadiliko katika ishara za GA zinazosababishwa na mabadiliko ya asili katika mkusanyiko wa GA.
Ili kuelewa kama shughuli ya ishara ya GA inayogunduliwa na qmRGA inategemea mkusanyiko wa GA na mtazamo wa GA, kama inavyotarajiwa kulingana na muundo wa kitambuzi, tulichambua usemi wa vipokezi vitatu vya GID1 katika tishu za mimea na uzazi. Katika miche, mstari wa mwandishi wa GID1-GUS ulionyesha kuwa GID1a na c zilionyeshwa sana katika kotyledons (Mchoro 3a–c). Kwa kuongezea, vipokezi vyote vitatu vilionyeshwa katika majani, mizizi ya pembeni ya mizizi, ncha za mizizi (isipokuwa kifuniko cha mizizi cha GID1b), na mfumo wa mishipa (Mchoro 3a–c). Katika SAM ya inflorescence, tuligundua ishara za GUS pekee kwa GID1b na 1c (Mchoro wa Nyongeza 7a–c). Uchanganyaji wa ndani ulithibitisha mifumo hii ya usemi na kuonyesha zaidi kwamba GID1c ilionyeshwa kwa usawa katika viwango vya chini katika SAM, ilhali GID1b ilionyesha usemi wa juu zaidi pembezoni mwa SAM (Mchoro wa Nyongeza 7d–l). Muunganisho wa tafsiri wa pGID1b::2xmTQ2-GID1b pia ulifunua kiwango cha usemi wa GID1b kilichopangwa, kuanzia usemi wa chini au usio na usemi katikati ya SAM hadi usemi wa juu kwenye mipaka ya viungo (Mchoro wa Nyongeza 7m). Hivyo, vipokezi vya GID1 havijasambazwa sawasawa kote na ndani ya tishu. Katika majaribio yaliyofuata, pia tuliona kwamba usemi wa GID1 kupita kiasi (pUBQ10::GID1a-mCherry) uliongeza unyeti wa qmRGA katika hypocotyls hadi matumizi ya nje ya GA (Mchoro 3d, e). Kwa upande mwingine, mwangaza uliopimwa na qd17mRGA katika hypocotyl haukuwa nyeti kwa matibabu ya GA3 (Mchoro 3f, g). Kwa majaribio yote mawili, miche ilitibiwa kwa viwango vya juu vya GA (100 μM GA3) ili kutathmini tabia ya haraka ya kitambuzi, ambapo uwezo wa kufungamana na kipokezi cha GID1 uliimarishwa au kupotea. Kwa pamoja, matokeo haya yanathibitisha kwamba kihisi cha kibiolojia cha qmRGA hufanya kazi ya pamoja kama kihisi cha GA na GA, na yanaonyesha kwamba usemi tofauti wa kipokezi cha GID1 unaweza kudhibiti kwa kiasi kikubwa utokaji wa kihisi.
Hadi leo, usambazaji wa ishara za GA katika SAM bado haujaeleweka. Kwa hivyo, tulitumia mimea inayoonyesha qmRGA na mwandishi wa seli shina wa pCLV3::mCherry-NLS35 kuhesabu ramani za kiasi zenye ubora wa juu za shughuli za kuashiria GA, tukizingatia safu ya L1 (epidermis; Mchoro 4a, b, tazama Mbinu na Mbinu za Ziada), kwa kuwa L1 ina jukumu muhimu katika kudhibiti ukuaji wa SAM36. Hapa, usemi wa pCLV3::mCherry-NLS ulitoa sehemu ya marejeleo ya kijiometri isiyobadilika kwa ajili ya kuchambua usambazaji wa anga wa shughuli za kuashiria GA37. Ingawa GA inachukuliwa kuwa muhimu kwa ukuaji wa viungo vya pembeni4, tuliona kwamba ishara za GA zilikuwa chini katika primordium ya maua (P) kuanzia hatua ya P3 (Mchoro 4a, b), ilhali primordium changa za P1 na P2 zilikuwa na shughuli za wastani sawa na zile katika eneo la kati (Mchoro 4a, b). Shughuli ya juu ya kuashiria GA iligunduliwa kwenye mipaka ya primordiamu ya kiungo, kuanzia P1/P2 (pembeni za mpaka) na kufikia kilele kwenye P4, na pia katika seli zote za eneo la pembeni lililopo kati ya primordia (Mchoro 4a, b na Mchoro wa Nyongeza 8a, b). Shughuli hii ya juu ya kuashiria GA ilizingatiwa sio tu kwenye epidermis bali pia katika tabaka za L2 na L3 za juu (Mchoro wa Nyongeza 8b). Muundo wa ishara za GA zilizogunduliwa katika SAM kwa kutumia qmRGA pia ulibaki bila kubadilika baada ya muda (Mchoro wa Nyongeza 8c–f, k). Ingawa muundo wa qd17mRGA ulipunguzwa kimfumo katika SAM ya mimea ya T3 kutoka kwa mistari mitano huru ambayo tuliibainisha kwa undani, tuliweza kuchambua mifumo ya fluorescence iliyopatikana kwa muundo wa pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Mchoro wa Nyongeza 8g–j, l). Katika mstari huu wa udhibiti, ni mabadiliko madogo tu katika uwiano wa fluorescence yaliyogunduliwa katika SAM, lakini katika kituo cha SAM tuliona kupungua kwa wazi na bila kutarajiwa kwa VENUS inayohusishwa na TagBFP. Hii inathibitisha kwamba muundo wa ishara unaoonekana na qmRGA unaonyesha uharibifu unaotegemea GA wa mRGA-VENUS, lakini pia unaonyesha kwamba qmRGA inaweza kuzidisha shughuli ya ishara ya GA katika kituo cha meristem. Kwa muhtasari, matokeo yetu yanaonyesha muundo wa ishara ya GA ambao kimsingi unaonyesha usambazaji wa primordia. Usambazaji huu wa eneo la kati ya primordial (IPR) unatokana na kuanzishwa polepole kwa shughuli ya juu ya ishara ya GA kati ya primordia inayoendelea na eneo la kati, huku wakati huo huo shughuli ya ishara ya GA katika primordia ikipungua (Mchoro 4c, d).
Usambazaji wa vipokezi vya GID1b na GID1c (tazama hapo juu) unaonyesha kwamba usemi tofauti wa vipokezi vya GA husaidia kuunda muundo wa shughuli ya ishara ya GA katika SAM. Tulijiuliza kama mkusanyiko tofauti wa GA unaweza kuhusika. Ili kuchunguza uwezekano huu, tulitumia kihisi cha nlsGPS1 GA FRET21. Ongezeko la masafa ya uanzishaji liligunduliwa katika SAM ya nlsGPS1 iliyotibiwa na 10 μM GA4+7 kwa dakika 100 (Mchoro wa Nyongeza 9a–e), ikionyesha kwamba nlsGPS1 hujibu mabadiliko katika mkusanyiko wa GA katika SAM, kama inavyofanya kwenye mizizi21. Usambazaji wa anga wa masafa ya uanzishaji wa nlsGPS1 ulionyesha viwango vya chini vya GA katika tabaka za nje za SAM, lakini ilionyesha kuwa viliinuliwa katikati na kwenye mipaka ya SAM (Mchoro 4e na Mchoro wa Nyongeza 9a,c). Hii inaonyesha kwamba GA pia imesambazwa katika SAM kwa muundo wa anga unaofanana na ule uliofunuliwa na qmRGA. Kama mbinu inayosaidiana, pia tulitibu SAM kwa GA ya fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) au Fl pekee kama kidhibiti hasi. Ishara ya Fl ilisambazwa kote SAM, ikijumuisha eneo la kati na primordium, ingawa kwa kiwango cha chini (Mchoro 4j na Mchoro wa Nyongeza 10d). Kwa upande mwingine, GA-Fl zote tatu zilikusanyika haswa ndani ya mipaka ya primordium na kwa viwango tofauti katika sehemu iliyobaki ya IPR, huku GA7-Fl ikikusanyika katika eneo kubwa zaidi katika IPR (Mchoro 4k na Mchoro wa Nyongeza 10a,b). Upimaji wa kiwango cha fluorescence ulionyesha kuwa uwiano wa IPR kwa kiwango kisicho cha IPR ulikuwa wa juu zaidi katika SAM iliyotibiwa na GA-Fl ikilinganishwa na SAM iliyotibiwa na Fl (Mchoro 4l na Mchoro wa Nyongeza 10c). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kuwa GA ipo katika viwango vya juu zaidi katika seli za IPR ambazo ziko karibu zaidi na mpaka wa kiungo. Hii inaonyesha kwamba muundo wa shughuli ya kuashiria ya SAM GA hutokana na usemi tofauti wa vipokezi vya GA na mkusanyiko tofauti wa GA katika seli za IPR karibu na mipaka ya viungo. Kwa hivyo, uchambuzi wetu ulifunua muundo usiotarajiwa wa anga na wakati wa kuashiria wa GA, ukiwa na shughuli ndogo katikati na msingi wa SAM na shughuli ya juu katika IPR katika eneo la pembeni.
Ili kuelewa jukumu la shughuli tofauti ya ishara ya GA katika SAM, tulichambua uhusiano kati ya shughuli ya ishara ya GA, upanuzi wa seli, na mgawanyiko wa seli kwa kutumia upigaji picha wa wakati halisi wa SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Kwa kuzingatia jukumu la GA katika udhibiti wa ukuaji, uhusiano mzuri na vigezo vya upanuzi wa seli ulitarajiwa. Kwa hivyo, kwanza tulilinganisha ramani za shughuli za ishara ya GA na ramani za kiwango cha ukuaji wa uso wa seli (kama kielelezo cha nguvu ya upanuzi wa seli kwa seli fulani na kwa seli binti katika mgawanyiko) na ramani za anisotropi ya ukuaji, ambayo hupima mwelekeo wa upanuzi wa seli (pia hutumika hapa kwa seli fulani na kwa seli binti katika mgawanyiko; Mchoro 5a,b, tazama Mbinu na Mbinu za Ziada). Ramani zetu za kiwango cha ukuaji wa uso wa seli za SAM zinaendana na uchunguzi wa awali38,39, huku viwango vya ukuaji vikiwa vidogo sana kwenye mpaka na viwango vya juu zaidi vya ukuaji katika maua yanayokua (Mchoro 5a). Uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) ulionyesha kuwa shughuli ya ishara ya GA ilihusiana vibaya na kiwango cha ukuaji wa uso wa seli (Mchoro 5c). Pia tulionyesha kwamba mihimili mikuu ya tofauti, ikiwa ni pamoja na ingizo la ishara ya GA na kiwango cha ukuaji, ilikuwa imeelekezwa kwa mwelekeo ulioamuliwa na usemi wa juu wa CLV3, ikithibitisha kutengwa kwa seli kutoka katikati ya SAM katika uchanganuzi uliobaki. Uchanganuzi wa uwiano wa Spearman ulithibitisha matokeo ya PCA (Mchoro 5d), ikionyesha kuwa ishara za juu za GA katika IPR hazikusababisha upanuzi wa juu wa seli. Hata hivyo, uchanganuzi wa uwiano ulifunua uhusiano chanya kidogo kati ya shughuli ya ishara ya GA na anisotropi ya ukuaji (Mchoro 5c, d), ikidokeza kwamba ishara za juu za GA katika IPR huathiri mwelekeo wa ukuaji wa seli na labda nafasi ya ndege ya mgawanyiko wa seli.
a, b Ramani za joto za ukuaji wa wastani wa uso (a) na anisotropi ya ukuaji (b) katika SAM zilikuwa na wastani wa mimea saba huru (iliyotumika kama viwakilishi vya nguvu na mwelekeo wa upanuzi wa seli, mtawalia). c Uchambuzi wa PCA ulijumuisha vigezo vifuatavyo: ishara ya GA, kiwango cha ukuaji wa uso, anisotropi ya ukuaji wa uso, na usemi wa CLV3. Sehemu ya PCA 1 ilihusiana vibaya zaidi na kiwango cha ukuaji wa uso na ilihusiana vyema na ishara ya GA. Sehemu ya PCA 2 ilihusiana vyema zaidi na anisotropi ya ukuaji wa uso na ilihusiana vibaya na usemi wa CLV3. Asilimia zinawakilisha tofauti iliyoelezwa na kila sehemu. d Uchambuzi wa uwiano wa Spearman kati ya ishara ya GA, kiwango cha ukuaji wa uso, na anisotropi ya ukuaji wa uso katika kiwango cha tishu bila kujumuisha CZ. Nambari iliyo kulia ni thamani ya Spearman rho kati ya vigezo viwili. Nyota zinaonyesha visa ambapo uwiano/uwiano hasi ni muhimu sana. e Taswira ya 3D ya seli za Col-0 SAM L1 kwa hadubini ya confocal. Kuta mpya za seli zilizoundwa katika SAM (lakini si primordium) kwa saa 10 zimepakwa rangi kulingana na thamani zao za pembe. Upau wa rangi unaonyeshwa kwenye kona ya chini kulia. Kipengee cha ndani kinaonyesha picha inayolingana ya 3D kwa saa 0. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. f Viwanja vya kisanduku vinaonyesha viwango vya mgawanyiko wa seli katika IPR na zisizo za IPR Col-0 SAM (n = mimea 10 huru). Mstari wa katikati unaonyesha wastani, na mipaka ya kisanduku inaonyesha asilimia ya 25 na 75. Masharubu yanaonyesha thamani za chini na za juu zilizoamuliwa na programu ya R. Thamani za P zilipatikana kwa kutumia jaribio la t lenye mikia miwili la Welch. g, h Mchoro wa kimkakati unaoonyesha (g) jinsi ya kupima pembe ya ukuta mpya wa seli (magenta) kuhusiana na mwelekeo wa radial kutoka katikati ya SAM (mstari mweupe wenye nukta) (thamani za pembe kali pekee, yaani, 0–90°, zinazingatiwa), na (h) mwelekeo wa mviringo/upande na radial ndani ya meristem. i Histogramu za masafa ya mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika SAM (bluu nyeusi), IPR (bluu ya kati), na zisizo za IPR (bluu nyepesi), mtawalia. Thamani za P zilipatikana kwa jaribio la Kolmogorov-Smirnov lenye mikia miwili. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. j Histogramu za masafa ya mwelekeo wa mgawanyiko wa seli wa IPR karibu na P3 (kijani kibichi), P4 (kijani cha kati), na P5 (kijani kibichi), mtawalia. Thamani za P zilipatikana kwa jaribio la Kolmogorov-Smirnov lenye mikia miwili. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa.
Kwa hivyo, tulichunguza uhusiano kati ya uashiriaji wa GA na shughuli ya mgawanyiko wa seli kwa kutambua kuta mpya za seli zilizoundwa wakati wa jaribio (Mchoro 5e). Mbinu hii ilituwezesha kupima masafa na mwelekeo wa mgawanyiko wa seli. Kwa kushangaza, tuligundua kuwa masafa ya mgawanyiko wa seli katika IPR na SAM iliyobaki (isiyo ya IPR, Mchoro 5f) yalikuwa sawa, ikionyesha kuwa tofauti katika uashiriaji wa GA kati ya seli za IPR na zisizo za IPR haziathiri sana mgawanyiko wa seli. Hii, na uhusiano mzuri kati ya uashiriaji wa GA na anisotropi ya ukuaji, ilituchochea kuzingatia kama shughuli ya uashiriaji wa GA inaweza kushawishi mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli. Tulipima mwelekeo wa ukuta mpya wa seli kama pembe kali inayohusiana na mhimili wa radial unaounganisha kituo cha meristem na katikati ya ukuta mpya wa seli (Mchoro 5e-i) na tukaona mwelekeo wazi wa seli kugawanyika kwa pembe karibu na 90° ikilinganishwa na mhimili wa radial, huku masafa ya juu zaidi yakizingatiwa katika 70–80° (23.28%) na 80–90° (22.62%) (Mchoro 5e,i), sambamba na mgawanyiko wa seli katika mwelekeo wa mzunguko/mzunguko (Mchoro 5h). Ili kuchunguza mchango wa ishara ya GA kwa tabia hii ya mgawanyiko wa seli, tulichambua vigezo vya mgawanyiko wa seli katika IPR na isiyo ya IPR kando (Mchoro 5i). Tuliona kwamba usambazaji wa pembe ya mgawanyiko katika seli za IPR ulitofautiana na ule ulio katika seli zisizo za IPR au katika seli katika SAM nzima, huku seli za IPR zikionyesha uwiano mkubwa wa mgawanyiko wa seli za pembeni/mviringo, yaani, 70–80° na 80–90° (33.86% na 30.71%, mtawalia, uwiano unaolingana) (Mchoro 5i). Kwa hivyo, uchunguzi wetu ulionyesha uhusiano kati ya ishara ya juu ya GA na mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli karibu na mwelekeo wa mzunguko, sawa na uhusiano kati ya shughuli ya ishara ya GA na anisotropi ya ukuaji (Mchoro 5c, d). Ili kubaini zaidi uhifadhi wa anga wa uhusiano huu, tulipima mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko katika seli za IPR zinazozunguka primordium kuanzia P3, kwani shughuli ya juu zaidi ya ishara ya GA iligunduliwa katika eneo hili kuanzia P4 (Mchoro 4). Pembe za mgawanyiko wa IPR karibu na P3 na P4 hazikuonyesha tofauti muhimu za kitakwimu, ingawa masafa yaliyoongezeka ya mgawanyiko wa seli za pembeni yalionekana katika IPR karibu na P4 (Mchoro 5j). Hata hivyo, katika seli za IPR karibu na P5, tofauti katika mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli ikawa muhimu kitakwimu, na ongezeko kubwa la masafa ya mgawanyiko wa seli mtambuka (Mchoro 5j). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba ishara ya GA inaweza kudhibiti mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika SAM, ambayo inaendana na ripoti za awali40,41 kwamba ishara ya juu ya GA inaweza kusababisha mwelekeo wa pembeni wa mgawanyiko wa seli katika IPR.
Inatabiriwa kwamba seli katika IPR hazitajumuishwa katika primordia bali katika internodes2,42,43. Mwelekeo wa mlalo wa mgawanyiko wa seli katika IPR unaweza kusababisha mpangilio wa kawaida wa safu sambamba za longitudinal za seli za epidermal katika internodes. Uchunguzi wetu ulioelezwa hapo juu unaonyesha kwamba ishara ya GA huenda ina jukumu katika mchakato huu kwa kudhibiti mwelekeo wa mgawanyiko wa seli.
Kupotea kwa utendaji kazi wa jeni kadhaa za DELLA husababisha mwitikio wa GA, na vibadilishaji vya della vinaweza kutumika kujaribu dhana hii44. Kwanza tulichambua mifumo ya usemi wa jeni tano za DELLA katika SAM. Muunganisho wa unukuzi wa mstari wa GUS45 ulionyesha kuwa GAI, RGA, RGL1, na RGL2 (kwa kiwango kidogo sana) zilionyeshwa katika SAM (Mchoro wa Nyongeza 11a–d). Uchanganyiko wa ndani ulionyesha zaidi kuwa mRNA ya GAI hujikusanya haswa katika maua ya awali na yanayokua (Mchoro wa Nyongeza 11e). MRNA ya RGL1 na RGL3 ziligunduliwa kote kwenye dari ya SAM na katika maua ya zamani, ilhali mRNA ya RGL2 ilikuwa nyingi zaidi katika eneo la mpaka (Mchoro wa Nyongeza 11f–h). Upigaji picha wa siri wa pRGL3::RGL3-GFP SAM ulithibitisha usemi ulioonekana na mseto wa ndani na ulionyesha kuwa protini ya RGL3 hujikusanya katika sehemu ya kati ya SAM (Mchoro wa Nyongeza 11i). Kwa kutumia mstari wa pRGA::GFP-RGA, tuligundua pia kwamba protini ya RGA hujilimbikiza katika SAM, lakini wingi wake hupungua kwenye mpaka kuanzia P4 (Mchoro wa Nyongeza 11j). Ikumbukwe kwamba, mifumo ya usemi wa RGL3 na RGA inaendana na shughuli ya juu ya ishara ya GA katika IPR, kama inavyogunduliwa na qmRGA (Mchoro 4). Zaidi ya hayo, data hizi zinaonyesha kwamba DELLA zote zinaonyeshwa katika SAM na kwamba usemi wao kwa pamoja unahusisha SAM nzima.
Kisha tulichambua vigezo vya mgawanyiko wa seli katika SAM ya aina ya porini (Ler, udhibiti) na mutants za gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (kimataifa) (Mchoro 6a, b). Cha kufurahisha ni kwamba, tuliona mabadiliko muhimu ya kitakwimu katika usambazaji wa masafa ya pembe ya mgawanyiko wa seli katika SAM ya kimataifa ya della ikilinganishwa na aina ya porini (Mchoro 6c). Mabadiliko haya katika mutant ya kimataifa ya della yalitokana na ongezeko la masafa ya pembe za 80–90° (34.71% dhidi ya 24.55%) na, kwa kiwango kidogo, pembe za 70–80° (23.78% dhidi ya 20.18%), yaani, zinazolingana na mgawanyiko wa seli unaovuka (Mchoro 6c). Masafa ya mgawanyiko usiovuka (0–60°) pia yalikuwa chini katika mutant ya kimataifa ya della (Mchoro 6c). Masafa ya mgawanyiko wa seli zinazovuka yaliongezeka kwa kiasi kikubwa katika SAM ya mutant ya kimataifa ya della (Mchoro 6b). Masafa ya mgawanyiko wa seli zinazovuka katika IPR pia yalikuwa ya juu katika mutant ya kimataifa ya della ikilinganishwa na aina ya porini (Mchoro 6d). Nje ya eneo la IPR, aina ya porini ilikuwa na usambazaji sawa wa pembe za mgawanyiko wa seli, ilhali mutant ya kimataifa ya della ilipendelea mgawanyiko wa tangential kama IPR (Mchoro 6e). Pia tulipima mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika SAM ya mutants tano za ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, na ga2ox6-2), mandharinyuma ya mutant isiyofanya kazi ya GA ambayo GA hujilimbikiza. Sambamba na ongezeko la viwango vya GA, SAM ya uanzilishi wa ga2ox wenye mabadiliko ya mara tano ilikuwa kubwa kuliko ile ya Col-0 (Mchoro wa Nyongeza 12a, b), na ikilinganishwa na Col-0, ga2ox SAM yenye ga2ox yenye idadi tano ilionyesha usambazaji tofauti kabisa wa pembe za mgawanyiko wa seli, huku masafa ya pembe yakiongezeka kutoka 50° hadi 90°, yaani tena ikipendelea mgawanyiko wa tangential (Mchoro wa Nyongeza 12a–c). Kwa hivyo, tunaonyesha kwamba uanzishaji wa ishara za GA na mkusanyiko wa GA husababisha mgawanyiko wa seli za pembeni katika IPR na SAM iliyobaki.
a, b taswira ya 3D ya safu ya L1 ya Ler (a) iliyotiwa madoa ya PI na mutant ya kimataifa ya della (b) SAM kwa kutumia hadubini ya confocal. Kuta mpya za seli zilizoundwa katika SAM (lakini si primordium) kwa kipindi cha saa 10 zinaonyeshwa na kupakwa rangi kulingana na thamani zao za pembe. Kipengee kilichopo kinaonyesha SAM kwa saa 0. Upau wa rangi unaonyeshwa kwenye kona ya chini kulia. Mshale katika (b) unaelekeza kwenye mfano wa faili za seli zilizopangwa katika mutant ya kimataifa ya della. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. ce ulinganisho wa usambazaji wa masafa ya mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika SAM nzima (d), IPR (e), na isiyo ya IPR (f) kati ya Ler na della ya kimataifa. Thamani za P zilipatikana kwa kutumia jaribio la Kolmogorov-Smirnov lenye mikia miwili. f, g taswira ya 3D ya picha za confocal za SAM iliyotiwa madoa ya PI ya mimea ya Col-0 (i) na pCUC2::gai-1-VENUS (j). Paneli (a, b) zinaonyesha kuta mpya za seli (lakini si primordia) zilizoundwa katika SAM ndani ya saa 10. Jaribio lilirudiwa mara mbili na matokeo sawa. h–j Ulinganisho wa usambazaji wa masafa ya mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli ulioko katika SAM nzima (h), IPR (i) na isiyo ya IPR (j) kati ya mimea ya Col-0 na pCUC2::gai-1-VENUS. Thamani za P zilipatikana kwa kutumia jaribio la Kolmogorov–Smirnov lenye mikia miwili.
Kisha tulijaribu athari ya kuzuia ishara ya GA haswa katika IPR. Kwa lengo hili, tulitumia kipandishi cha kikombe cha kotyledon 2 (CUC2) kuendesha usemi wa protini hasi ya gai-1 iliyounganishwa na VENUS (katika mstari wa pCUC2::gai-1-VENUS). Katika SAM ya aina ya porini, kipandishi cha CUC2 huendesha usemi wa IPR nyingi katika SAM, ikijumuisha seli za mpaka, kuanzia P4 na kuendelea, na usemi maalum kama huo ulionekana katika mimea ya pCUC2::gai-1-VENUS (tazama hapa chini). Usambazaji wa pembe za mgawanyiko wa seli kwenye SAM au IPR ya mimea ya pCUC2::gai-1-VENUS haukuwa tofauti sana na ule wa aina ya porini, ingawa bila kutarajia tuligundua kuwa seli zisizo na IPR katika mimea hii ziligawanyika kwa masafa ya juu ya 80–90° (Mchoro 6f–j).
Imependekezwa kwamba mwelekeo wa mgawanyiko wa seli hutegemea jiometri ya SAM, haswa mkazo wa mvutano unaotokana na mkunjo wa tishu46. Kwa hivyo tuliuliza ikiwa umbo la SAM lilibadilishwa katika mimea ya della global mutant na pCUC2::gai-1-VENUS. Kama ilivyoripotiwa hapo awali12, ukubwa wa della global mutant SAM ulikuwa mkubwa kuliko ule wa aina ya porini (Mchoro wa Nyongeza 13a, b, d). Mseto wa CLV3 na STM RNA katika hali halisi ulithibitisha upanuzi wa meristem katika della mutants na zaidi ulionyesha upanuzi wa pembeni wa niche ya seli shina (Mchoro wa Nyongeza 13e, f, h, i). Hata hivyo, mkunjo wa SAM ulikuwa sawa katika jenotype zote mbili (Mchoro wa Nyongeza 13k, m, n, p). Tuliona ongezeko sawa la ukubwa katika mutant ya gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple bila mabadiliko katika mkunjo ikilinganishwa na aina ya mwitu (Mchoro wa Nyongeza 13c, d, g, j, l, o, p). Masafa ya mwelekeo wa mgawanyiko wa seli pia yaliathiriwa katika mutant ya della quadruple, lakini kwa kiwango kidogo kuliko katika mutant ya della monolithic (Mchoro wa Nyongeza 12d–f). Athari hii ya kipimo, pamoja na ukosefu wa athari kwenye mkunjo, inaonyesha kwamba shughuli iliyobaki ya RGL3 katika mutant ya Della quadruple hupunguza mabadiliko katika mwelekeo wa mgawanyiko wa seli unaosababishwa na kupotea kwa shughuli ya DELLA na kwamba mabadiliko katika mgawanyiko wa seli za pembeni hutokea kutokana na mabadiliko katika shughuli ya ishara ya GA badala ya mabadiliko katika jiometri ya SAM. Kama ilivyoelezwa hapo juu, kipandishaji cha CUC2 huendesha usemi wa IPR katika SAM kuanzia P4 (Mchoro wa Nyongeza 14a, b), na kwa upande mwingine, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ilikuwa na ukubwa uliopunguzwa lakini mkunjo wa juu zaidi (Mchoro wa Nyongeza 14c–h). Mabadiliko haya katika mofolojia ya pCUC2::gai-1-VENUS SAM yanaweza kusababisha usambazaji tofauti wa mikazo ya kiufundi ikilinganishwa na aina ya mwituni, ambapo mikazo ya juu ya mviringo huanza kwa umbali mfupi kutoka katikati ya SAM47. Vinginevyo, mabadiliko katika mofolojia ya pCUC2::gai-1-VENUS SAM yanaweza kusababisha mabadiliko katika sifa za mitambo ya kikanda yanayosababishwa na usemi wa transgene48. Katika visa vyote viwili, hii inaweza kupunguza kwa kiasi athari za mabadiliko katika ishara ya GA kwa kuongeza uwezekano kwamba seli zitagawanyika katika mwelekeo wa mviringo/mviringo, ikielezea uchunguzi wetu.
Kwa pamoja, data yetu inathibitisha kwamba ishara ya juu ya GA ina jukumu kubwa katika mwelekeo wa pembeni wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika IPR. Pia zinaonyesha kwamba mkunjo wa meristem pia huathiri mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli katika IPR.
Mwelekeo wa mlalo wa ndege ya mgawanyiko katika IPR, kutokana na shughuli kubwa ya ishara ya GA, unaonyesha kwamba GA hupanga faili ya seli ya radial katika epidermis ndani ya SAM ili kufafanua mpangilio wa seli ambao utapatikana baadaye katika internode ya epidermal. Hakika, faili kama hizo za seli zilionekana mara kwa mara katika picha za SAM za mutants za della global (Mchoro 6b). Kwa hivyo, ili kuchunguza zaidi kazi ya ukuaji wa muundo wa anga wa ishara ya GA katika SAM, tulitumia upigaji picha wa muda mfupi kuchanganua mpangilio wa anga wa seli katika IPR katika mimea ya aina ya porini (Ler na Col-0), mutants za della global, na pCUC2::gai-1-VENUS transgenic.
Tuligundua kuwa qmRGA ilionyesha kuwa shughuli ya kuashiria GA katika IPR iliongezeka kutoka P1/P2 na kufikia kilele cha P4, na muundo huu ulibaki sawa baada ya muda (Mchoro 4a–f na Mchoro wa Nyongeza. 8c–f, k). Ili kuchambua mpangilio wa anga wa seli katika IPR kwa kuongeza ishara ya GA, tuliweka lebo kwenye seli za Ler IPR hapo juu na pande za P4 kulingana na hatima yao ya ukuaji iliyochambuliwa saa 34 baada ya uchunguzi wa kwanza, yaani, zaidi ya mara mbili za plastidi, na kuturuhusu kufuata seli za IPR wakati wa ukuaji wa primordium kutoka P1/P2 hadi P4. Tulitumia rangi tatu tofauti: njano kwa seli zile zilizounganishwa kwenye primordium karibu na P4, kijani kwa zile zilizokuwa kwenye IPR, na zambarau kwa zile zilizoshiriki katika michakato yote miwili (Mchoro 7a–c). Katika t0 (0 h), tabaka 1–2 za seli za IPR zilionekana mbele ya P4 (Mchoro 7a). Kama ilivyotarajiwa, seli hizi zilipogawanyika, zilifanya hivyo hasa kupitia ndege ya mgawanyiko wa mlalo (Michoro 7a–c). Matokeo sawa yalipatikana kwa kutumia Col-0 SAM (ikizingatia P3, ambayo mpaka wake hujikunja sawa na P4 katika Ler), ingawa katika aina hii ya jenoti mkunjo ulioundwa kwenye mpaka wa maua ulificha seli za IPR haraka zaidi (Mchoro 7g–i). Hivyo, muundo wa mgawanyiko wa seli za IPR hupanga seli katika safu wima, kama ilivyo katika internodes. Mpangilio wa safu wima na ujanibishaji wa seli za IPR kati ya viungo vinavyofuatana unaonyesha kwamba seli hizi ni vizazi vya kati ya nodi.
Hapa, tuliunda kihisi cha ishara cha GA cha uwiano, qmRGA, kinachoruhusu uchoraji ramani wa kiasi cha shughuli za ishara za GA zinazotokana na viwango vya pamoja vya vipokezi vya GA na GA huku tukipunguza kuingiliwa na njia za ishara za asili, na hivyo kutoa taarifa kuhusu utendaji kazi wa GA katika kiwango cha seli. Kwa lengo hili, tuliunda protini ya DELLA iliyorekebishwa, mRGA, ambayo imepoteza uwezo wa kufunga washirika wa mwingiliano wa DELLA lakini inabaki kuwa nyeti kwa proteolysis inayosababishwa na GA. qmRGA hujibu mabadiliko ya nje na ya asili katika viwango vya GA, na sifa zake za kuhisi nguvu huwezesha tathmini ya mabadiliko ya anga katika shughuli za ishara za GA wakati wa maendeleo. qmRGA pia ni kifaa kinachonyumbulika sana kwani kinaweza kubadilishwa kwa tishu tofauti kwa kubadilisha kipandishi kinachotumika kwa usemi wake (ikiwa ni lazima), na kutokana na hali iliyohifadhiwa ya njia ya ishara ya GA na motifu ya PFYRE kwenye angiosperms, kuna uwezekano wa kuhamishiwa kwa spishi zingine22. Sambamba na hili, mabadiliko sawa katika protini ya mchele SLR1 DELLA (HYY497AAA) pia yalionyeshwa kukandamiza shughuli ya kikandamizaji cha ukuaji wa SLR1 huku ikipunguza kidogo tu uharibifu wake unaosababishwa na GA, sawa na mRGA23. Ikumbukwe kwamba tafiti za hivi karibuni katika Arabidopsis zilionyesha kuwa mabadiliko moja ya amino asidi katika kikoa cha PFYRE (S474L) yalibadilisha shughuli ya unukuzi wa RGA bila kuathiri uwezo wake wa kuingiliana na washirika wa vipengele vya unukuzi50. Ingawa mabadiliko haya yanakaribiana sana na mbadala 3 wa amino asidi zilizopo katika mRGA, tafiti zetu zinaonyesha kuwa mabadiliko haya mawili hubadilisha sifa tofauti za DELLA. Ingawa washirika wengi wa vipengele vya unukuzi hufungamana na vikoa vya LHR1 na SAW vya DELLA26,51, baadhi ya amino asidi zilizohifadhiwa katika kikoa cha PFYRE zinaweza kusaidia kuleta utulivu katika mwingiliano huu.
Ukuaji wa nodi za ndani ni sifa muhimu katika usanifu wa mimea na uboreshaji wa mavuno. qmRGA ilionyesha shughuli kubwa ya kuashiria GA katika seli za kizazi cha ndani cha IPR. Kwa kuchanganya upigaji picha wa kiasi na jeni, tulionyesha kuwa mifumo ya kuashiria GA inaweka ndege za mgawanyiko wa seli za mviringo/mviringo katika epidermis ya SAM, na kuunda mpangilio wa mgawanyiko wa seli unaohitajika kwa ajili ya ukuaji wa nodi za ndani. Vidhibiti kadhaa vya mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli vimetambuliwa wakati wa maendeleo52,53. Kazi yetu inatoa mfano wazi wa jinsi shughuli ya kuashiria GA inavyodhibiti kigezo hiki cha seli. DELLA inaweza kuingiliana na tata za protini za awali41, kwa hivyo kuashiria GA kunaweza kudhibiti mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli kwa kushawishi moja kwa moja mwelekeo wa microtubule ya gamba40,41,54,55. Tulionyesha bila kutarajia kwamba katika SAM, uhusiano wa shughuli ya kuashiria GA ya juu haukuwa upanuzi wa seli au mgawanyiko, bali ni anisotropi ya ukuaji tu, ambayo inaendana na athari ya moja kwa moja ya GA kwenye mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika IPR. Hata hivyo, hatuwezi kutenga kwamba athari hii inaweza pia kuwa isiyo ya moja kwa moja, kwa mfano inayosababishwa na ulainishaji wa ukuta wa seli unaosababishwa na GA56. Mabadiliko katika sifa za ukuta wa seli husababisha msongo wa kimakanika57,58, ambao unaweza pia kushawishi mwelekeo wa ndege ya mgawanyiko wa seli kwa kuathiri mwelekeo wa mikrotubuli za gamba39,46,59. Athari za pamoja za msongo wa kimakanika unaosababishwa na GA na udhibiti wa moja kwa moja wa mwelekeo wa mikrotubuli na GA zinaweza kuhusika katika kutoa muundo maalum wa mwelekeo wa mgawanyiko wa seli katika IPR ili kufafanua mikrotubuli, na tafiti zaidi zinahitajika ili kujaribu wazo hili. Vile vile, tafiti za awali zimeangazia umuhimu wa protini zinazoingiliana na DELLA TCP14 na 15 katika udhibiti wa uundaji wa mikrotubuli60,61 na mambo haya yanaweza kuingiliana na kitendo cha GA pamoja na BREVIPEDICELUS (BP) na PENNYWISE (PNY), ambazo hudhibiti ukuaji wa mikrotubuli na zimeonyeshwa kushawishi ishara ya GA2,62. Kwa kuzingatia kwamba DELLA huingiliana na njia za kuashiria za brassinosteroid, ethilini, asidi ya jasmoniki, na asidi ya abscisic (ABA)63,64 na kwamba homoni hizi zinaweza kushawishi mwelekeo wa mikrotubuli65, athari za GA kwenye mwelekeo wa mgawanyiko wa seli zinaweza pia kusababishwa na homoni zingine.
Uchunguzi wa awali wa saitolojia ulionyesha kuwa maeneo ya ndani na nje ya Arabidopsis SAM yanahitajika kwa ajili ya ukuaji wa nodi za ndani2,42. Ukweli kwamba GA hudhibiti kikamilifu mgawanyiko wa seli katika tishu za ndani12 huunga mkono kazi mbili za GA katika kudhibiti ukubwa wa meristem na nodi za ndani katika SAM. Muundo wa mgawanyiko wa seli za mwelekeo pia unadhibitiwa kwa ukali katika tishu za ndani za SAM, na kanuni hii ni muhimu kwa ukuaji wa shina52. Itakuwa ya kuvutia kuchunguza kama GA pia ina jukumu katika kuelekeza ndege ya mgawanyiko wa seli katika mpangilio wa ndani wa SAM, na hivyo kusawazisha vipimo na ukuzaji wa nodi za ndani ndani ya SAM.
Mimea ilipandwa ndani ya udongo au kwa kiwango cha 1 cha Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) kilichoongezewa 1% ya sucrose na 1% agar (Sigma) chini ya hali ya kawaida (saa 16 za mwanga, 22 °C), isipokuwa majaribio ya hypocotyl na ukuaji wa mizizi ambapo miche ilipandwa kwenye sahani wima chini ya mwanga usiobadilika na 22 °C. Kwa majaribio ya nitrati, mimea ilipandwa kwenye kiwango cha MS kilichobadilishwa (kiwango cha mimea cha bioWORLD) kilichoongezewa nitrati ya kutosha (0 au 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose na 1% A-agar (Sigma) chini ya hali ya siku ndefu.
GID1a cDNA iliyoingizwa kwenye pDONR221 iliunganishwa tena na pDONR P4-P1R-pUBQ10 na pDONR P2R-P3-mCherry kwenye pB7m34GW ili kutoa pBQ10::GID1a-mCherry. DNA ya IDD2 iliyoingizwa kwenye pDONR221 iliunganishwa tena kwenye pB7RWG266 ili kutoa p35S:IDD2-RFP. Ili kutengeneza pGID1b::2xmTQ2-GID1b, kipande cha kb 3.9 juu ya eneo la usimbaji wa GID1b na kipande cha kb 4.7 chenye cDNA ya GID1b (1.3 kb) na kimaliziaji (3.4 kb) viliongezwa kwanza kwa kutumia vitangulizi katika Jedwali la Ziada la 3 na kisha kuingizwa kwenye pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) na pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), mtawalia, na hatimaye kuunganishwa tena na pDONR221 2xmTQ268 kwenye vekta lengwa ya pGreen 012567 kwa kutumia uundaji wa Gateway. Ili kutoa pCUC2::LSSmOrange, mfuatano wa kipandishi cha CUC2 (3229 bp juu ya ATG) ukifuatiwa na mfuatano wa usimbaji wa mOrange kubwa iliyobadilishwa ya Stokes (LSSmOrange)69 yenye ishara ya ujanibishaji wa nyuklia ya N7 na kimalizio cha unukuzi cha NOS vilikusanywa kwenye vekta ya kulenga pGreen kanamycin kwa kutumia mfumo wa uunganishaji wa vipande 3 vya Gateway (Invitrogen). Vekta ya binary ya mmea iliingizwa kwenye aina ya Agrobacterium tumefaciens GV3101 na kuingizwa kwenye majani ya Nicotiana benthamiana kwa njia ya kupenya ya Agrobacterium na ndani ya Arabidopsis thaliana Col-0 kwa njia ya kuzamisha maua, mtawalia. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry na pCLV3::mCherry-NLS qmRGA zilitengwa kutoka kwa vizazi vya F3 na F1 vya misalaba husika, mtawalia.
Uchanganyiko wa RNA katika hali ulifanywa kwenye ncha za takriban sentimita 1 za shina zenye urefu wa 72, ambazo zilikusanywa na kuwekwa mara moja katika suluhisho la FAA (3.7% formaldehyde, 5% asidi asetiki, 50% ethanoli) iliyopozwa hadi 4 °C. Baada ya matibabu ya utupu ya dakika 2 × 15, kiambatisho kilibadilishwa na sampuli ziliwekwa kwenye incubation usiku kucha. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, na RGL3 cDNAs na probes za antisense kwa 3′-UTRs zao zilitengenezwa kwa kutumia primers zilizoonyeshwa kwenye Jedwali la Ziada 3 kama ilivyoelezwa na Rosier et al.73. Vipimo vyenye lebo ya Digoxigenin viligunduliwa kwa kutumia kingamwili za digoxigenin (mchanganyiko mara 3000; Roche, nambari ya katalogi: 11 093 274 910), na sehemu zilipakwa rangi na 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, mchanganyiko mara 250)/nitroblue tetrazolium (NBT, mchanganyiko mara 200).
Muda wa chapisho: Februari-10-2025