Katika utafiti huu, athari za kichocheo cha matibabu ya pamoja yavidhibiti vya ukuaji wa mimea(2,4-D na kinetini) na chembechembe ndogo za oksidi ya chuma (Fe₃O₄-NPs) kwenye umbo la ndani ya vitro na uzalishaji wa metaboliti ya pili katika *Hypericum perforatum* L. zilichunguzwa. Matibabu bora [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetini (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] yaliboresha kwa kiasi kikubwa vigezo vya ukuaji wa mmea: urefu wa mmea uliongezeka kwa 59.6%, urefu wa mzizi kwa 114.0%, idadi ya chipukizi kwa 180.0%, na uzito mpya wa callus kwa 198.3% ikilinganishwa na kundi la udhibiti. Matibabu haya ya pamoja pia yaliongeza ufanisi wa kuzaliwa upya (50.85%) na kuongeza kiwango cha hypericin kwa 66.6%. Uchambuzi wa GC-MS ulionyesha kiwango cha juu cha hyperoside, β-patolene, na pombe ya setili, ikichangia 93.36% ya eneo lote la kilele, huku kiwango cha jumla cha fenoliki na flavonoidi kikiongezeka kwa hadi 80.1%. Matokeo haya yanaonyesha kuwa vidhibiti ukuaji wa mimea (PGRs) na chembechembe ndogo za Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) hutoa athari ya ushirikiano kwa kuchochea organogenesis na mkusanyiko wa misombo hai ya kibiolojia, ambayo inawakilisha mkakati mzuri wa uboreshaji wa kibiolojia wa mimea ya dawa.
Wort wa St. John (Hypericum perforatum L.), pia unaojulikana kama wort wa St. John, ni mmea wa mimea wa kudumu wa familia ya Hypericaceae ambao una thamani ya kiuchumi.[1] Vipengele vyake vinavyoweza kuwa hai ni pamoja na tanini asilia, xanthoni, phloroglucinol, naphthalenedianthrone (hyperin na pseudohyperin), flavonoids, asidi za fenoli, na mafuta muhimu.[2,3,4] Wort wa St. John unaweza kuenezwa kwa njia za kitamaduni; hata hivyo, msimu wa mbinu za kitamaduni, kuota kidogo kwa mbegu, na uwezekano wa magonjwa hupunguza uwezo wake wa kilimo kikubwa na malezi endelevu ya metaboliti za sekondari.[1,5,6]
Kwa hivyo, uundaji wa tishu za ndani ya vitro unachukuliwa kuwa njia bora ya uenezaji wa haraka wa mimea, uhifadhi wa rasilimali za vijidudu, na ongezeko la mavuno ya misombo ya dawa [7, 8]. Vidhibiti vya ukuaji wa mimea (PGRs) vina jukumu muhimu katika kudhibiti umbo la mimea na ni muhimu kwa kilimo cha ndani ya vitro cha callus na viumbe vizima. Uboreshaji wa viwango na michanganyiko yao ni muhimu kwa kukamilisha kwa mafanikio michakato hii ya maendeleo [9]. Kwa hivyo, kuelewa muundo na mkusanyiko unaofaa wa vidhibiti ni muhimu kwa kuboresha ukuaji na uwezo wa kuzaliwa upya wa wort ya St. John (H. perforatum) [10].
Chembe chembe ndogo za oksidi ya chuma (Fe₃O₄) ni kundi la chembe chembe ndogo ambazo zimetengenezwa au zinatengenezwa kwa ajili ya uundaji wa tishu. Fe₃O₄ ina sifa muhimu za sumaku, utangamano mzuri wa kibiolojia, na uwezo wa kukuza ukuaji wa mimea na kupunguza msongo wa mazingira, kwa hivyo imevutia umakini mkubwa katika miundo ya uundaji wa tishu. Matumizi yanayowezekana ya chembe chembe hizi ndogo yanaweza kujumuisha kuboresha uundaji wa ndani ya vitro ili kukuza mgawanyiko wa seli, kuboresha ufyonzaji wa virutubisho, na kuamsha vimeng'enya vya antioxidant [11].
Ingawa chembe chembe ndogo zimeonyesha athari nzuri za kukuza ukuaji wa mimea, tafiti kuhusu matumizi ya pamoja ya chembe chembe ndogo za Fe₃O₄ na vidhibiti vilivyoboreshwa vya ukuaji wa mimea katika *H. perforatum* bado ni chache. Ili kujaza pengo hili la maarifa, utafiti huu ulitathmini athari za athari zao za pamoja kwenye umbo la ndani ya vitro na uzalishaji wa metaboliti wa sekondari ili kutoa maarifa mapya ya kuboresha sifa za mimea ya dawa. Kwa hivyo, utafiti huu una malengo mawili: (1) kuboresha mkusanyiko wa vidhibiti vya ukuaji wa mimea ili kukuza kwa ufanisi uundaji wa callus, kuzaliwa upya kwa shina, na mizizi katika vitro; na (2) kutathmini athari za chembe chembe ndogo za Fe₃O₄ kwenye vigezo vya ukuaji katika vitro. Mipango ya siku zijazo ni pamoja na kutathmini kiwango cha kuishi kwa mimea iliyozaliwa upya wakati wa kuzoea (katika vitro). Inatarajiwa kwamba matokeo ya utafiti huu yataboresha kwa kiasi kikubwa ufanisi wa uenezaji mdogo wa *H. perforatum*, na hivyo kuchangia matumizi endelevu na matumizi ya kibayolojia ya mmea huu muhimu wa dawa.
Katika utafiti huu, tulipata miche ya majani kutoka kwa mimea ya kila mwaka ya wort ya St. John (mimea mama) inayokuzwa shambani. Mimea hii ya majani ilitumika kuboresha hali ya ufugaji wa vitro. Kabla ya kuchuja, majani yalisafishwa vizuri chini ya maji yaliyochujwa kwa dakika kadhaa. Sehemu za mimea ya majani zilisafishwa kwa kuzama kwenye ethanoli 70% kwa sekunde 30, ikifuatiwa na kuzamishwa kwenye mchanganyiko wa 1.5% wa sodiamu hypochlorite (NaOCl) ulio na matone machache ya Tween 20 kwa dakika 10. Hatimaye, miche hiyo ilisukwa mara tatu kwa maji yaliyochujwa kabla ya kuhamishiwa kwenye chombo kinachofuata cha ufugaji.
Katika kipindi cha wiki nne zilizofuata, vigezo vya kuzaliwa upya kwa shina vilipimwa, ikiwa ni pamoja na kiwango cha kuzaliwa upya, idadi ya shina kwa kila mmea uliopandwa, na urefu wa shina. Wakati shina zilizozaliwa upya zilipofikia urefu wa angalau sentimita 2, zilihamishiwa kwenye mfumo wa mizizi ulio na nusu nguvu ya MS, 0.5 mg/L asidi ya indolebutyric (IBA), na 0.3% guar gum. Uundaji wa mizizi uliendelea kwa wiki tatu, wakati ambapo kiwango cha mizizi, idadi ya mizizi, na urefu wa mizizi vilipimwa. Kila matibabu yalirudiwa mara tatu, huku miche 10 ikipandwa kwa kila mmea ulioigwa, na kutoa takriban miche 30 kwa kila matibabu.
Urefu wa mmea ulipimwa kwa sentimita (cm) kwa kutumia rula, kuanzia chini ya mmea hadi ncha ya jani refu zaidi. Urefu wa mizizi ulipimwa kwa milimita (mm) mara tu baada ya kuondoa miche kwa uangalifu na kuondoa sehemu ya kati inayokua. Idadi ya machipukizi kwa kila mmea uliopandwa ilihesabiwa moja kwa moja kwenye kila mmea. Idadi ya madoa meusi kwenye majani, yanayojulikana kama vinundu, ilipimwa kwa macho. Vinundu hivi vyeusi vinaaminika kuwa tezi zenye hypericin, au madoa ya oksidi, na hutumika kama kiashiria cha kisaikolojia cha mwitikio wa mmea kwa matibabu. Baada ya kuondoa sehemu yote ya kati inayokua, uzito mpya wa miche ulipimwa kwa kutumia kipimo cha kielektroniki chenye usahihi wa miligramu (mg).
Mbinu ya kuhesabu kiwango cha uundaji wa callus ni kama ifuatavyo: baada ya kukuza miche katika chombo chenye vidhibiti mbalimbali vya ukuaji (kinases, 2,4-D, na Fe3O4) kwa wiki nne, idadi ya miche inayoweza kuunda callus huhesabiwa. Fomula ya kuhesabu kiwango cha uundaji wa callus ni kama ifuatavyo:
Kila matibabu yalirudiwa mara tatu, huku angalau vipandikizi 10 vikichunguzwa katika kila marudio.
Kiwango cha kuzaliwa upya huonyesha uwiano wa tishu za callus zinazokamilisha kwa mafanikio mchakato wa utofautishaji wa chipukizi baada ya hatua ya uundaji wa callus. Kiashiria hiki kinaonyesha uwezo wa tishu za callus kubadilika kuwa tishu tofauti na kukua na kuwa viungo vipya vya mmea.
Kipimo cha mizizi ni uwiano wa idadi ya matawi yanayoweza kuota mizizi kwa jumla ya idadi ya matawi. Kiashiria hiki kinaonyesha mafanikio ya hatua ya kuota mizizi, ambayo ni muhimu katika uenezaji mdogo na uenezaji wa mimea, kwani mizizi mizuri husaidia miche kuishi vyema katika hali ya ukuaji.
Misombo ya Hypericin ilitolewa kwa kutumia methanoli 90%. Miligramu hamsini za mimea iliyokaushwa ziliongezwa kwenye 1 ml ya methanoli na kusuguliwa kwa dakika 20 kwa 30 kHz katika kisafishaji cha ultrasonic (modeli A5120-3YJ) kwenye joto la kawaida gizani. Baada ya sonication, sampuli iliwekwa kwenye centrifuge kwa kasi ya 6000 rpm kwa dakika 15. Supernatant ilikusanywa, na ufyonzaji wa hypericin ulipimwa kwa 592 nm kwa kutumia spectrophotometer ya Plus-3000 S kulingana na mbinu iliyoelezwa na Conceiçao et al. [14].
Matibabu mengi yenye vidhibiti ukuaji wa mimea (PGRs) na chembe chembe ndogo za oksidi ya chuma (Fe₃O₄-NPs) hayakusababisha uundaji wa vinundu vyeusi kwenye majani yaliyochipua upya. Hakuna vinundu vilivyoonekana katika matibabu yoyote yenye kinetini ya 0.5 au 1 mg/L 2,4-D, 0.5 au 1 mg/L, au chembe chembe ndogo za oksidi ya chuma 1, 2, au 4 mg/L. Michanganyiko michache ilionyesha ongezeko kidogo la ukuaji wa vinundu (lakini si muhimu kitakwimu) katika viwango vya juu vya chembe chembe ndogo za kinetini na/au oksidi ya chuma, kama vile mchanganyiko wa 2,4-D (0.5–2 mg/L) na kinetini (1–1.5 mg/L) na chembe chembe ndogo za oksidi ya chuma (2–4 mg/L). Matokeo haya yanaonyeshwa kwenye Mchoro 2. Vinundu vyeusi vinawakilisha tezi zenye hypericin nyingi, zote zinazotokea kiasili na zenye manufaa. Katika utafiti huu, vinundu vyeusi vilihusishwa zaidi na kubadilika rangi kwa tishu, kuonyesha mazingira mazuri ya mkusanyiko wa hypericin. Matibabu yenye chembe chembe ndogo za 2,4-D, kinetini, na Fe₃O₄ yalikuza ukuaji wa callus, kupunguza kahawia, na kuongezeka kwa kiwango cha klorofili, ikidokeza utendakazi bora wa kimetaboliki na uwezekano wa kupunguza uharibifu wa oksidi [37]. Utafiti huu ulitathmini athari za kinetini pamoja na chembe chembe ndogo za 2,4-D na Fe₃O₄ kwenye ukuaji na ukuaji wa callus ya wort ya St. John (Mchoro 3a–g). Uchunguzi uliopita umeonyesha kuwa chembe chembe ndogo za Fe₃O₄ zina shughuli za kuzuia vimelea na antimicrobial [38, 39] na, zinapotumiwa pamoja na vidhibiti vya ukuaji wa mimea, zinaweza kuchochea mifumo ya ulinzi wa mimea na kupunguza viashiria vya msongo wa seli [18]. Ingawa biosynthesis ya metaboliti za sekondari inadhibitiwa kijenetiki, mavuno yao halisi yanategemea sana hali ya mazingira. Mabadiliko ya kimetaboliki na kimofolojia yanaweza kushawishi viwango vya metaboliti za sekondari kwa kudhibiti usemi wa jeni maalum za mimea na kujibu mambo ya mazingira. Zaidi ya hayo, vichochezi vinaweza kusababisha uanzishaji wa jeni mpya, ambazo huchochea shughuli za kimeng'enya, hatimaye kuamsha njia nyingi za kibiolojia na kusababisha uundaji wa metaboliti za sekondari. Zaidi ya hayo, utafiti mwingine ulionyesha kuwa kupunguza kivuli huongeza mfiduo wa jua, na hivyo kuongeza halijoto ya mchana katika makazi asilia ya *Hypericum perforatum*, ambayo pia huchangia kuongezeka kwa mavuno ya hypericin. Kulingana na data hizi, utafiti huu ulichunguza jukumu la chembe chembe ndogo za chuma kama vichochezi vinavyowezekana katika utamaduni wa tishu. Matokeo yalionyesha kuwa chembe chembe hizi ndogo zinaweza kuamsha jeni zinazohusika katika biosanisi ya hesperidin kupitia kichocheo cha kimeng'enya, na kusababisha kuongezeka kwa mkusanyiko wa kiwanja hiki (Mchoro 2). Kwa hivyo, ikilinganishwa na mimea inayokua chini ya hali ya asili, inaweza kusemwa kwamba uzalishaji wa misombo kama hiyo katika mwili unaweza pia kuimarishwa wakati mkazo wa wastani unajumuishwa na uanzishaji wa jeni zinazohusika katika biosanisi ya metaboliti za sekondari. Matibabu ya mchanganyiko kwa ujumla yana athari chanya kwenye kiwango cha kuzaliwa upya, lakini katika baadhi ya matukio, athari hii hudhoofika. Ikumbukwe kwamba, matibabu na 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinase, na viwango tofauti vinaweza kuongeza kwa kujitegemea na kwa kiasi kikubwa kiwango cha kuzaliwa upya kwa 50.85% ikilinganishwa na kundi la udhibiti (Mchoro 4c). Matokeo haya yanaonyesha kwamba michanganyiko maalum ya nanohomoni inaweza kutenda kwa ushirikiano ili kukuza ukuaji wa mimea na uzalishaji wa metaboli, ambayo ni muhimu sana kwa utamaduni wa tishu za mimea ya dawa. Palmer na Keller [50] walionyesha kuwa matibabu ya 2,4-D yanaweza kusababisha uundaji wa callus kwa kujitegemea katika St. perforatum, huku kuongezwa kwa kinase kukiboresha kwa kiasi kikubwa uundaji na kuzaliwa upya kwa callus. Athari hii ilitokana na uboreshaji wa usawa wa homoni na kuchochea mgawanyiko wa seli. Bal et al. [51] waligundua kuwa matibabu ya Fe₃O₄-NP yanaweza kuongeza kwa kujitegemea utendakazi wa vimeng'enya vya antioxidant, na hivyo kukuza ukuaji wa mizizi katika St. perforatum. Vyombo vya habari vya uenezaji vyenye chembe chembe ndogo za Fe₃O₄ katika viwango vya 0.5 mg/L, 1 mg/L, na 1.5 mg/L viliboresha kiwango cha urejeshaji wa mimea ya kitani [52]. Matumizi ya kinetini, chembe chembe ndogo za 2,4-dichlorobenzothiazolinone, na chembe chembe ndogo za Fe₃O₄ yaliboresha kwa kiasi kikubwa viwango vya uundaji wa callus na mizizi, hata hivyo, athari zinazowezekana za kutumia homoni hizi kwa urejeshaji wa ndani ya vitro zinahitaji kuzingatiwa. Kwa mfano, matumizi ya muda mrefu au ya juu ya mkusanyiko wa 2,4-dichlorobenzothiazolinone au kinetini yanaweza kusababisha tofauti ya kloni ya somatic, mkazo wa oksidi, umbo lisilo la kawaida la callus, au vitrification. Kwa hivyo, kiwango cha juu cha urejeshaji haimaanishi lazima utabiri uthabiti wa kijenetiki. Mimea yote iliyorejeshwa inapaswa kupimwa kwa kutumia alama za molekuli (km RAPD, ISSR, AFLP) au uchambuzi wa saitojenetiki ili kubaini usawa na kufanana kwao na mimea ya ndani ya vivo [53,54,55].
Utafiti huu ulionyesha kwa mara ya kwanza kwamba matumizi ya pamoja ya vidhibiti ukuaji wa mimea (2,4-D na kinetini) pamoja na chembechembe ndogo za Fe₃O₄ yanaweza kuongeza umbo na mkusanyiko wa metaboliti muhimu za kibiolojia (ikiwa ni pamoja na hypericin na hyperoside) katika *Hypericum perforatum*. Utaratibu bora wa matibabu (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetini + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) haukuongeza tu uundaji wa callus, organogenesis, na mavuno ya metaboliti ya pili lakini pia ulionyesha athari ndogo ya kuchochea, ikiwezekana kuboresha uvumilivu wa mfadhaiko wa mmea na thamani ya kimatibabu. Mchanganyiko wa nanoteknolojia na utamaduni wa tishu za mimea hutoa jukwaa endelevu na lenye ufanisi kwa ajili ya uzalishaji mkubwa wa misombo ya dawa katika vitro. Matokeo haya yanafungua njia kwa matumizi ya viwanda na utafiti wa siku zijazo kuhusu mifumo ya molekuli, uboreshaji wa kipimo na usahihi wa kijenetiki, na hivyo kuunganisha utafiti wa msingi kuhusu mimea ya dawa na bioteknolojia ya vitendo.
Muda wa chapisho: Desemba 12-2025