Dawa ya anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEETImeripotiwa kuzuia AChE (asetilikolinesterasi) na ina sifa zinazoweza kusababisha saratani kutokana na kuongezeka kwa mishipa ya damu. Katika karatasi hii, tunaonyesha kwamba DEET huchochea hasa seli za endothelial zinazokuza angiogenesis, na hivyo kuongeza ukuaji wa uvimbe. DEET huamsha michakato ya seli inayosababisha angiogenesis, ikiwa ni pamoja na kuongezeka, uhamiaji, na mshikamano. Hii inahusishwa na ongezeko la uzalishaji wa NO na usemi wa VEGF katika seli za endothelial. Kunyamazisha M3 au kutumia vizuizi vya kifamasia vya M3 kulifuta athari hizi zote, ikidokeza kwamba angiogenesis inayosababishwa na DEET ina nyeti kwa M3. Majaribio yanayohusisha uashiriaji wa kalsiamu katika seli za endothelial na HEK zinazotoa vipokezi vya M3 kupita kiasi, pamoja na tafiti za kufunga na kufunga, zinaonyesha kuwa DEET hufanya kazi kama kidhibiti cha allosteriki cha vipokezi vya M3. Zaidi ya hayo, DEET huzuia AChE, na hivyo kuongeza upatikanaji wa acetylcholine na mshikamano wake na vipokezi vya M3, na kuongeza athari za proangiogenic kupitia udhibiti wa allosteriki.
EC za msingi zilitengwa kutoka kwa aorta ya panya wa Uswisi. Mbinu ya uchimbaji ilibadilishwa kutoka kwa itifaki ya Kobayashi 26. EC za murine zilikuzwa katika hali ya kati ya EBM-2 iliyoongezewa na FBS isiyo na joto ya 5% hadi kifungu cha nne.
Athari ya viwango viwili vya DEET kwenye kuenea kwa HUVEC, U87MG, au BF16F10 ilichambuliwa kwa kutumia Kifaa cha Kupima Kuenea kwa Seli cha CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Kwa kifupi, seli 5.103 kwa kila kisima zilipandwa kwenye sahani ya visima 96, zikaruhusiwa kushikamana usiku kucha, na kisha kutibiwa na DEET kwa saa 24. Baada ya kuondoa njia ya ukuaji, ongeza suluhisho la kuunganisha rangi kwenye kila kisima cha microplate na uziangushe seli kwenye 37 °C kwa dakika 30. Viwango vya mwangaza viliamuliwa kwa kutumia kisomaji cha microplate cha Mithras LB940 multimode (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Ujerumani) kilicho na vichujio vya uchochezi vya 485 nm na vichujio vya utoaji wa 530 nm.
HUVEC ilipandwa katika sahani za visima 96 kwa msongamano wa seli 104 kwa kila kisima. Seli zilitibiwa na DEET kwa saa 24. Uwezo wa seli kustawi ulipimwa kwa kutumia kipimo cha rangi cha MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Thamani za msongamano wa macho zilipatikana kwenye kisomaji cha microplate cha multimode (Mithras LB940) kwa urefu wa wimbi la 570 nm.
Athari za DEET zilisomwa kwa kutumia majaribio ya angiogenesis ndani ya vitro. Matibabu yenye 10-8 M au 10-5 M DEET iliongeza uundaji wa urefu wa kapilari katika HUVECs (Mchoro 1a, b, baa nyeupe). Ikilinganishwa na kundi la udhibiti, matibabu yenye viwango vya DEET kuanzia 10-14 hadi 10-5 M yalionyesha kuwa urefu wa kapilari ulifikia kiwango cha juu katika 10-8 M DEET (Mchoro wa Nyongeza S2). Hakuna tofauti kubwa iliyopatikana katika athari ya proangiogenic ndani ya vitro ya HUVECs zilizotibiwa na DEET katika kiwango cha mkusanyiko cha 10-8 M na 10-5 M.
Ili kubaini athari ya DEET kwenye neovascularization, tulifanya tafiti za neovascularization ndani ya mwili. Baada ya siku 14, panya waliodungwa sindano zenye seli za endothelial zilizopandwa kabla ya 10-8 M au 10-5 M DEET walionyesha ongezeko kubwa la kiwango cha hemoglobini (Mchoro 1c, baa nyeupe).
Zaidi ya hayo, uundaji wa mishipa mipya ya damu unaosababishwa na DEET ulisomwa katika panya waliobeba xenograft ya U87MG ambao walidungwa sindano ya kila siku (ip) na DEET kwa kipimo kinachojulikana kusababisha viwango vya plasma vya 10-5 M, ambayo ni ya kawaida kwa wanadamu walio wazi. katika 23. Vivimbe vinavyoonekana (yaani uvimbe >100 mm3) vilizingatiwa siku 14 baada ya sindano ya seli za U87MG kwa panya. Siku ya 28, ukuaji wa uvimbe uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika panya waliotibiwa na DEET ikilinganishwa na panya wa kudhibiti (Mchoro 1d, mraba). Zaidi ya hayo, madoa ya CD31 ya uvimbe yalionyesha kuwa DEET iliongeza kwa kiasi kikubwa eneo la kapilari lakini si msongamano wa mishipa midogo. (Mchoro 1e–g).
Ili kubaini jukumu la vipokezi vya muscarinic katika kuongezeka kunakosababishwa na DETA, 10-8 M au 10-5 M DETA mbele ya pFHHSiD (10-7 M, mpinzani teule wa kipokezi cha M3) ilitumika. Matibabu ya HUVEC. pFHHSiD ilizuia kabisa sifa za kuongezeka kwa DETA katika viwango vyote (Jedwali 1).
Chini ya hali hizi, pia tulichunguza kama DEET ingeongeza urefu wa kapilari katika seli za HUVEC. Vile vile, pFHHSiD ilizuia kwa kiasi kikubwa urefu wa kapilari unaosababishwa na DEET (Mchoro 1a, b, baa za kijivu). Zaidi ya hayo, majaribio kama hayo yalifanywa na siRNA ya M3. Ingawa siRNA ya udhibiti haikuwa na ufanisi katika kukuza uundaji wa kapilari, kunyamazisha kipokezi cha muscarinic cha M3 kuliondoa uwezo wa DEET kuongeza urefu wa kapilari (Mchoro 1a, b, baa nyeusi).
Zaidi ya hayo, mishipa yote miwili ya damu iliyosababishwa na DEET ya 10-8 M au 10-5 M katika vitro na mishipa mipya ya damu katika mwili ilizuiwa kabisa na pFHHSiD (Mchoro 1c, d, duru). Matokeo haya yanaonyesha kuwa DEET inakuza angiogenesis kupitia njia nyeti kwa wapinzani teule wa vipokezi vya M3 au siRNA ya M3.
AChE ndio shabaha ya molekuli ya DEET. Dawa kama vile donepezil, ambazo hufanya kazi kama vizuizi vya AChE, zinaweza kuchochea angiogenesis ya EC katika vitro na katika mifano ya ischemia ya miguu ya nyuma ya panya14. Tulijaribu athari ya viwango viwili vya DEET kwenye shughuli ya kimeng'enya cha AChE katika HUVEC. Viwango vya chini (10-8 M) na vya juu (10-5 M) vya DEET vilipunguza shughuli ya AChE ya endothelial ikilinganishwa na hali za udhibiti (Mchoro 2).
Viwango vyote viwili vya DEET (10-8 M na 10-5 M) vilipunguza shughuli ya asetilikolinesterasi kwenye HUVEC. BW284c51 (10-5 M) ilitumika kama udhibiti wa vizuizi vya asetilikolinesterasi. Matokeo yanaonyeshwa kama asilimia ya shughuli ya AChE kwenye HUVEC iliyotibiwa na viwango viwili vya DEET ikilinganishwa na seli zilizotibiwa na gari. Thamani zinaonyeshwa kama wastani ± SEM ya majaribio sita huru. *p < 0.05 ikilinganishwa na udhibiti (jaribio la kulinganisha la Kruskal-Wallis na Dunn).
Oksidi ya nitriki (NO) inahusika katika mchakato wa angiogenic 33, kwa hivyo, uzalishaji wa NO katika HUC zilizochochewa na DEET ulisomwa. Uzalishaji wa NO wa endothelial uliotibiwa na DEET uliongezeka ikilinganishwa na seli za udhibiti, lakini ulifikia umuhimu tu kwa kipimo cha 10-8 M (Mchoro 3c). Ili kubaini mabadiliko ya molekuli yanayodhibiti uzalishaji wa NO unaosababishwa na DEET, usemi na uanzishaji wa eNOS ulichambuliwa kwa kutumia Western blotting. Ingawa matibabu ya DEET hayakubadilisha usemi wa eNOS, yaliongeza fosforasi ya eNOS kwa kiasi kikubwa katika eneo lake la kuwasha (Ser-1177) huku yakipunguza eneo lake la kuzuia (Thr-495) ikilinganishwa na seli ambazo hazijatibiwa katika fosforasi ya eNOS (Mchoro 3d). Zaidi ya hayo, uwiano wa eNOS iliyo na fosforasi katika eneo la kuwasha na eneo la kuzuia ulihesabiwa baada ya kurekebisha kiasi cha eNOS iliyo na fosforasi hadi jumla ya kiasi cha kimeng'enya. Uwiano huu uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika HUCEC zilizotibiwa kwa kila mkusanyiko wa DEET ikilinganishwa na seli ambazo hazijatibiwa (Mchoro 3d).
Hatimaye, usemi wa VEGF, mojawapo ya vipengele vikuu vya proangiogenic, ulichambuliwa kwa kutumia Western blotting. DEET iliongeza kwa kiasi kikubwa usemi wa VEGF, ilhali pFHHSiD ilizuia kabisa usemi huu.
Kwa kuwa athari za DEET ni nyeti kwa kizuizi cha kifamasia na kupungua kwa vipokezi vya M3, tulijaribu dhana kwamba DEET inaweza kuongeza ishara ya kalsiamu. Cha kushangaza, DEET ilishindwa kuongeza kalsiamu ya saitoplazimu katika HUVEC (data haijaonyeshwa) na HEK/M3 (Mchoro 4a, b) kwa viwango vyote viwili vilivyotumika.
Muda wa chapisho: Desemba-30-2024