Dawa ya anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) imeripotiwa kuzuia AChE (acetylcholinesterase) na ina sifa zinazoweza kusababisha kansa kutokana na mshipa mwingi wa mishipa. Katika karatasi hii, tunaonyesha kwamba DEET huchochea hasa seli za endothelial zinazokuza angiogenesis, na hivyo kuongeza ukuaji wa tumor. DEET huwezesha michakato ya seli inayoongoza kwa angiojenesisi, ikiwa ni pamoja na kuenea, uhamiaji, na kushikamana. Hii inahusishwa na kuongezeka kwa uzalishaji wa HAPANA na usemi wa VEGF katika seli za endothelial. Kunyamazisha M3 au kutumia vizuizi vya dawa vya M3 kulikomesha athari hizi zote, na kupendekeza kwamba angiogenesis inayotokana na DEET ni nyeti kwa M3. Majaribio yanayohusisha uwekaji ishara wa kalsiamu katika seli za mwisho na za HEK zinazodhihirisha kupita kiasi vipokezi vya M3, pamoja na tafiti za kuunganisha na kuweka kizimbani, zinaonyesha kuwa DEET hufanya kazi kama moduli ya allosteric ya vipokezi vya M3. Zaidi ya hayo, DEET huzuia AChE, na hivyo kuongeza upatikanaji wa kibayolojia wa asetilikolini na kumfunga kwa vipokezi vya M3, na kuimarisha athari za proangijeniki kupitia udhibiti wa allosteric.
EC za msingi zilitengwa kutoka kwa aorta ya panya wa Uswizi. Njia ya uchimbaji ilichukuliwa kutoka itifaki ya Kobayashi 26 . Murine ECs zilikuzwa katika EBM-2 kati zikisaidiwa na FBS 5% isiyo na joto hadi kifungu cha nne.
Athari ya viwango viwili vya DEET kwenye uenezaji wa HUVEC, U87MG, au BF16F10 ilichanganuliwa kwa kutumia Kitengo cha Uchunguzi wa Kueneza Seli ya CyQUANT (Vichunguzi vya Molecular, C7026). Kwa kifupi, seli 5.103 kwa kila kisima zilipandwa kwenye sahani yenye visima 96, kuruhusiwa kushikamana usiku kucha, na kisha kutibiwa na DEET kwa h 24. Baada ya kuondoa chombo cha ukuaji, ongeza suluhisho la kuunganisha rangi kwenye kila kisima cha microplate na uangushe seli kwa 37 °C kwa dakika 30. Viwango vya Fluorescence viliamuliwa kwa kutumia kisomaji cha Mithras LB940 cha multimode multimode (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Ujerumani) kilicho na vichujio vya kusisimua vya nm 485 na vichujio vya kutoa 530 nm.
HUVEC zilipandwa katika sahani zenye visima 96 kwa msongamano wa seli 104 kwa kila kisima. Seli zilitibiwa na DEET kwa saa 24. Umuhimu wa kisanduku ulitathminiwa kwa kutumia kipimo cha rangi ya MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Thamani za wiani wa macho zilipatikana kwenye kisomaji cha multimode microplate (Mithras LB940) kwa urefu wa 570 nm.
Madhara ya DEET yalichunguzwa kwa kutumia vipimo vya in vitro angiogenesis. Matibabu na 10-8 M au 10-5 M DEET iliongeza uundaji wa urefu wa capillary katika HUVECs (Mchoro 1a, b, baa nyeupe). Ikilinganishwa na kikundi cha udhibiti, matibabu na viwango vya DEET kuanzia 10-14 hadi 10-5 M ilionyesha kuwa urefu wa capillary ulifikia uwanda wa 10-8 M DEET (Mchoro wa ziada wa S2). Hakuna tofauti kubwa iliyopatikana katika athari ya in vitro proangiogenic ya HUVECs zilizotibiwa na DEET katika safu ya mkusanyiko ya 10-8 M na 10-5 M.
Kuamua athari za DEET kwenye neovascularization, tulifanya katika tafiti za uboreshaji wa mishipa. Baada ya siku 14, panya hudungwa na seli endothelial precultured na 10-8 M au 10-5 M DEET ilionyesha ongezeko kubwa katika maudhui hemoglobin (Mchoro 1c, baa nyeupe).
Zaidi ya hayo, upanyaji wa neovascularization unaosababishwa na DEET ulifanyiwa utafiti katika panya wenye kuzaa xenograft wa U87MG ambao walidungwa kila siku (ip) na DEET kwa kipimo kinachojulikana kusababisha viwango vya plasma vya 10-5 M, ambayo ni kawaida kwa wanadamu walio wazi. katika 23. Vivimbe vinavyoweza kugunduliwa (yaani uvimbe> 100 mm3) vilizingatiwa siku 14 baada ya kudunga seli za U87MG kwenye panya. Siku ya 28, ukuaji wa tumor uliimarishwa kwa kiasi kikubwa katika panya zilizotibiwa na DEET ikilinganishwa na panya za udhibiti (Mchoro 1d, mraba). Zaidi ya hayo, uchafuzi wa CD31 wa uvimbe ulionyesha kuwa DEET iliongeza kwa kiasi kikubwa eneo la kapilari lakini si msongamano wa mishipa midogo. (Mchoro 1e-g).
Kuamua jukumu la vipokezi vya muscarinic katika uenezi unaosababishwa na DETA, 10-8 M au 10-5 M DETA mbele ya pFHHSiD (10-7 M, mpinzani wa M3 wa kuchagua) ilitumiwa. Matibabu ya HUVEC. pFHHSiD ilizuia kabisa sifa za kuenea za DETA katika viwango vyote (Jedwali 1).
Chini ya hali hizi, tulichunguza pia ikiwa DEET ingeongeza urefu wa kapilari katika seli za HUVEC. Vile vile, pFHHSiD ilizuia kwa kiasi kikubwa urefu wa capillary unaosababishwa na DEET (Mchoro 1a, b, baa za kijivu). Zaidi ya hayo, majaribio sawa yalifanywa na M3 siRNA. Ingawa siRNA ya kudhibiti haikuwa na ufanisi katika kukuza malezi ya kapilari, kunyamazisha kipokezi cha muscarinic cha M3 kilikomesha uwezo wa DEET kuongeza urefu wa kapilari (Mchoro 1a, b, paa nyeusi).
Zaidi ya hayo, wote 10-8 M au 10-5 M DEET-ikiwa vascularization katika vitro na neovascularization katika vivo walikuwa kabisa imefungwa na pFHHSiD (Mchoro 1c, d, miduara). Matokeo haya yanaonyesha kuwa DEET inakuza angiojenesisi kupitia njia nyeti kwa wapinzani teule wa vipokezi vya M3 au M3 siRNA.
AChE ni lengo la molekuli la DEET. Dawa kama vile donepezil, ambayo hufanya kazi kama vizuizi vya AChE, inaweza kuchochea angiogenesis ya EC katika vitro na katika miundo ya ischemia ya nyuma ya panya14. Tulijaribu athari za viwango viwili vya DEET kwenye shughuli ya kimeng'enya cha AChE katika HUVEC. Mkusanyiko wa chini (10-8 M) na wa juu (10-5 M) wa DEET ulipungua shughuli za AChE za mwisho ikilinganishwa na hali ya udhibiti (Mchoro 2).
Viwango vyote viwili vya DEET (10-8 M na 10-5 M) vilipunguza shughuli ya asetilikolinesterasi kwenye HUVEC. BW284c51 (10-5 M) ilitumika kama kidhibiti cha vizuizi vya asetilikolinesterasi. Matokeo yanaonyeshwa kama asilimia ya shughuli za AChE kwenye HUVEC iliyotibiwa na viwango viwili vya DEET ikilinganishwa na seli zinazotibiwa kwenye gari. Maadili yanaonyeshwa kama wastani ± SEM ya majaribio sita huru. *p <0.05 ikilinganishwa na udhibiti (Kruskal-Wallis na Dunn nyingi kulinganisha mtihani).
Oksidi ya nitriki (NO) inahusika katika mchakato wa angiogenic 33, kwa hivyo, HAKUNA uzalishaji katika HUVEC zilizochochewa na DEET ulichunguzwa. DEET-kutibiwa endothelial NO uzalishaji iliongezeka ikilinganishwa na seli kudhibiti, lakini kufikiwa umuhimu tu katika kipimo cha 10-8 M (Mtini. 3c). Ili kubaini mabadiliko ya molekuli inayodhibiti uzalishaji wa NO unaosababishwa na DEET, usemi wa eNOS na kuwezesha vilichanganuliwa na ufutaji wa Magharibi. Ingawa matibabu ya DEET hayakubadilisha usemi wa eNOS, iliongeza kwa kiasi kikubwa phosphorylation ya eNOS kwenye tovuti yake ya kuwezesha (Ser-1177) huku ikipunguza tovuti yake ya kuzuia (Thr-495) ikilinganishwa na seli ambazo hazijatibiwa katika fosforasi ya eNOS (Mchoro 3d). Zaidi ya hayo, uwiano wa eNOS ya fosforasi kwenye tovuti ya kuwezesha na tovuti ya kizuizi ilihesabiwa baada ya kurejesha kiasi cha eNOS ya fosforasi kwa jumla ya kiasi cha kimeng'enya. Uwiano huu uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika HUVEC zilizotibiwa kwa kila mkusanyiko wa DEET ikilinganishwa na seli ambazo hazijatibiwa (Mchoro 3d).
Hatimaye, usemi wa VEGF, mojawapo ya sababu kuu za proangiogenic, ulichambuliwa na uzuiaji wa Magharibi. DEET iliongeza kwa kiasi kikubwa usemi wa VEGF, ilhali pFHHSiD ilizuia usemi huu kabisa .
Kwa kuwa athari za DEET ni nyeti kwa kuziba kwa dawa na kupunguza udhibiti wa vipokezi vya M3, tulijaribu dhana kwamba DEET inaweza kuongeza uashiriaji wa kalsiamu. Jambo la kushangaza ni kwamba DEET imeshindwa kuongeza kalsiamu ya cytoplasmic katika HUVEC (data haijaonyeshwa) na HEK/M3 (Mchoro 4a, b) kwa viwango vyote viwili vilivyotumika.
Muda wa kutuma: Dec-30-2024