Dawa za kuua wadudu zina jukumu muhimu katika kushughulikia uhaba wa chakula duniani na kupambana na magonjwa ya binadamu yanayoenezwa na wadudu. Hata hivyo, tatizo linalokua la upinzani wa dawa za kuua wadudu linahitaji ugunduzi wa haraka wa misombo mipya inayolenga shabaha ambazo hazijatumika kikamilifu. Njia za uwezo wa vipokezi vya muda mfupi vya wadudu (TRPV)—Nanzhong (Nan) na zisizofanya kazi (Iav)—zinaweza kuunda njia tofauti (Nan-Iav) na kuziweka katika viungo vya hisi vinavyoathiri geotropi, kusikia, na utambuzi wa wadudu. Baadhi ya dawa za kuua wadudu, kama vile aphidopyrrolidone (AP), hulenga Nan-Iav kupitia mifumo isiyojulikana. AP inafanya kazi dhidi ya wadudu wanaotoboa-kunyonya (hemipterans), kuzuia kulisha kwa kuvuruga utendaji kazi wa nyuzi. AP inaweza kujifunga kwa Nan pekee, lakini Nan-Iav pekee ndiyo inayoweza kuingiliana na agonisti, ikiwa ni pamoja na nicotinamide ya asili (NAM), na hivyo kuonyesha shughuli za njia. Licha ya uwezo wa Nan-Iav kama shabaha ya dawa za kuua wadudu, machache yanajulikana kuhusu mkusanyiko wake wa njia, maeneo ya kisheria ya kufungamana, na udhibiti unaotegemea Ca2+, na hivyo kuzuia maendeleo zaidi ya dawa za kuua wadudu. Katika utafiti huu, hadubini ya cryo-elektroni ilitumika kubaini muundo wa Nan-Iav katika wadudu wa Hemiptera katika hali ya kutokuwa na calmodulin-ligand, pamoja na AP na NAM kwenye mpaka wa kikoa cha saitoplazimu kinachorudia ankyrin (ARD). Cha kushangaza, tuligundua kuwa protini ya Nan yenyewe inaweza kuunda pentamer, ambayo imetulia kwa mwingiliano wa ARD unaosimamiwa na AP. Utafiti huu unaonyesha mwingiliano wa molekuli kati ya dawa za kuua wadudu na agonists na Nan-Iav, ikiangazia umuhimu wa ARD katika utendakazi na mkusanyiko wa chaneli, na kuchunguza utaratibu wa udhibiti wa Ca2+.
Kutokana na mabadiliko makubwa ya tabianchi duniani, kuzorota kwa usalama wa chakula duniani ni mojawapo ya changamoto kubwa za karne ya 21, huku matokeo yake yakizidi kuwa mabaya kwa jamii.1,2Ripoti ya Hali ya Usalama wa Chakula na Lishe Duniani ya Shirika la Afya Duniani ya 2023 (SOFI) inakadiria kuwa takriban watu bilioni 2.33 duniani kote wanakabiliwa na uhaba wa chakula wa wastani hadi mkubwa, tatizo la muda mrefu.3,4Kwa bahati mbaya, wastani wa 20% hadi 30% au zaidi ya mavuno ya mazao hupotea kila mwaka kutokana na wadudu na vimelea vya magonjwa, na ongezeko la joto duniani linatarajiwa kuzidisha upinzani wa wadudu na udhaifu wa mazao.4,5,6,7,8Ukuzaji wa dawa za wadudu ni muhimu sio tu kulinda mazao kutokana na wadudu na kupunguza kuenea kwa vimelea vinavyoenezwa na wadudu, lakini pia kupambana na magonjwa ya binadamu yanayoenezwa na wadudu kama vile homa ya dengue, malaria, na ugonjwa wa Chagas, ambao unazidi kuwa sugu kwa dawa za wadudu.5,9,10,11
Miongoni mwa shabaha kuu za dawa za kuua wadudu zenye sumu ya neva, chaneli ya heterotetrameric TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) inawakilisha kundi la shabaha za dawa za kuua wadudu zilizogunduliwa katika muongo mmoja uliopita, ikiwa ni pamoja na dawa za kuua wadudu zinazopatikana kibiashara kama vile imidacloprid na pyraclostrobin.12,13,14Dawa ya kuua wadudu aina ya aphidopyrrolifen (AP) iliyotengenezwa kwa nusu ni bidhaa iliyotengenezwa hivi karibuni na kuuzwa ambayo sehemu yake kuu ni dawa ya kuua wadudu inayofanya kazi Inscalis®, ambayo hufunga AP katika kiwango cha shughuli za chini ya nanomola.15AP inaonyesha sumu kali kidogo kwa wachavushaji, wadudu wenye manufaa, na viumbe vingine visivyolengwa, na inapotumiwa kulingana na maagizo ya lebo, inaweza kupunguza shinikizo la upinzani kwa dawa zingine za kuua wadudu.16,17,18Nan na Iav zimesambazwa sana katika spishi zote za wadudu, huonyeshwa kwa pamoja tu katika niuroni za vipokezi vya kunyoosha kwa korda za antena na viungo, na ni muhimu kwa kusikia, utambuzi wa uvutano, na utambuzi wa kibinafsi.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, na pyraclostrobin huchochea mchanganyiko wa Nan-Iav kupitia utaratibu wa kipekee, hatimaye kuzuia upitishaji wa ishara za proprioceptive.13,16,23Katika wadudu wanaonyonya kwa kutoboa (hemipterans) kama vile aphids na whiteflies, kupoteza uwezo wa kufahamu umiliki wa wadudu huathiri uwezo wao wa kulisha, na hatimaye kusababisha kifo.13,24Cha kufurahisha ni kwamba, AP inaonyesha mshikamano mkubwa kwa mchanganyiko wa Nan-Iav na mshikamano mdogo kwa Nan pekee. Kuunganishwa kwa AP na Nan-Iav husababisha mkondo wa umeme, lakini kuunganishwa na Nan pekee hakuchochei shughuli za chaneli. Iav yenyewe haishikamani na AP hata kidogo.16Hii inaonyesha kwamba Nan na Iav zinaweza kuungana na kuunda michanganyiko tofauti ya njia ya Nan-Iav (km, kwa uwiano tofauti wa stoichiometric au mpangilio tofauti ndani ya uwiano sawa wa stoichiometric) au kwamba AP inaweza kuungana na maeneo mengi. Zaidi ya hayo, nikotinamidi asilia ya agonist (NAM) huungana na Drosophila Nan-Iav kwa mshikamano wa mikromola, ikionyesha athari sawa na zile za aphids (AP) katika vitro.16,25na kuzuia uzazi na ulaji wa vidukari, na hatimaye kusababisha kifo chao25,26. Data hizi huibua maswali mengi. Kwa mfano, bado haijulikani wazi jinsi heterodimer ya Nan-Iav inavyoundwa, ni maeneo gani ya kufungamana hutumika kurekebisha molekuli ndogo, na jinsi molekuli hizi ndogo hudhibiti utendaji kazi wa chaneli kwa kukandamiza utambulisho wa kibinafsi. Zaidi ya hayo, sababu za kwa nini Nan yenyewe haifanyi kazi na ina mshikamano mdogo kwa AP, huku heterodimer ya Nan-Iav ikiwa hai na hufunga AP kwa mshikamano wa juu, bado haijulikani wazi. Hatimaye, machache yanajulikana kuhusu udhibiti unaotegemea Ca2+ wa utendaji kazi wa Nan-Iav na jinsi unavyounganishwa katika michakato ya uashiriaji wa neva.. 13,21
Katika utafiti huu, tukichanganya hadubini ya cryo-elektroni, elektrofiziolojia, na mbinu za kuunganisha radioligandi, tulifafanua mkusanyiko wa Nan-Iav na utaratibu wa kuunganisha kwake kwa vidhibiti vidogo vya molekuli. Zaidi ya hayo, tuligundua calmodulin (CaM) iliyounganishwa kwa Iav na pentameri za Nan zilizoimarishwa na AP. Matokeo haya yanatoa ufahamu muhimu kuhusu udhibiti wa ioni za kalsiamu katika njia, mkusanyiko wa njia, na mambo yanayoamua mshikamano wa kuunganisha ligandi. Muhimu zaidi, tulithibitisha kwamba ARD ina jukumu kuu katika michakato hii. Utafiti wetu wa njia kamili za wadudu zilizounganishwa na dawa za kuulia wadudu husika za kilimo.27, 28, 29Hufungua matarajio ya maendeleo ya tasnia ya dawa za kuulia wadudu, kuboresha ufanisi na umahususi wa dawa za kuulia wadudu, na kuwezesha matumizi ya misombo inayolengwa na TRPV kwa spishi zingine ili kushughulikia usalama wa chakula duniani na kuenea kwa magonjwa yanayoenezwa na wadudu.
Pia tuligundua kuwa Nan-Iav inadhibitiwa na Ca2+, na utaratibu wa udhibiti unasimamiwa na CaM iliyofungwa kwa utaratibu. Muhimu zaidi, udhibiti huu unaotegemea Ca2+ wa Nav na CaM hutofautiana sana na utaratibu wa udhibiti wa njia zingine za ioni (km, njia za Na+ zilizowekwa na volteji na njia za TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Katika chaneli ya Nav1.2, kikoa cha C-terminal cha CaM kinahusiana kiheliki na kikoa cha C-terminal (CTD), na Ca2+ husababisha kuunganishwa kwa kikoa chake cha N-terminal hadi sehemu ya mbali ya CTD.56Katika chaneli ya TRPV5/6, kikoa cha C-terminal cha CaM hufungamana na CTH, na Ca2+ husababisha upanuzi wa juu wa kikoa chake cha N-terminal ndani ya kinyweleo, na hivyo kuzuia upenyezaji wa katoni.53,54. Tunapendekeza kielelezo cha utendaji kazi unaodhibitiwa na Ca2+ wa Nan-Iav-CaM (Mchoro 4h). Katika kielelezo hiki, kikoa cha N-terminal cha CaM hufungamana na kikoa cha C-terminal (CTH) cha Iav. Katika hali ya kupumzika (mkusanyiko mdogo wa [Ca2+], kikoa cha C-terminal cha CaM huingiliana na Nan, na kuleta utulivu wa umbo la ARD na hivyo kukuza ufunguzi wa chaneli. Kufunga kwa agonist/wadudu kwenye chaneli husababisha ufunguzi wa vinyweleo, na kusababisha mtiririko wa Ca2+. Kisha Ca2+ hufungamana na CaM, na kusababisha kutengana kwa kikoa cha C-terminal kutoka kwa ARD ya Nan. Kwa sababu kuzuia kufungamana kwa CaM kimsingi huondoa athari ya kizuizi ya Ca2+, kutengana huku hurekebisha uhamaji wa ARD, na hivyo kusababisha kizuizi au upunguzaji wa unyeti unaotegemea Ca2+. Kupona haraka kwa mikondo ya chaneli baada ya kuondoa ioni za kalsiamu (Mchoro 4g) kunaonyesha kwamba utaratibu huu hurahisisha majibu ya haraka kwa ishara za neva zinazosababishwa na Ca2+. Zaidi ya hayo, eneo la C-terminal la Iav, ambalo bado halijaeleweka vizuri, limeripotiwa kuchukua majukumu mengine katika kulenga njia na kanuni za sasa.21
Hatimaye, utafiti wetu unawasilisha muundo wa ubora wa juu wa chaneli ya TRP ya wadudu-wadudu yenye umuhimu wa kilimo—ugunduzi ambao hatukuwahi kuujua hapo awali. Ikumbukwe kwamba tuliainisha muundo na kazi ya chaneli ya wadudu katika seli za binadamu (HEK293S GnTi–) badala ya katika seli za wadudu. Katika kukabiliana na kuongezeka kwa upinzani wa wadudu na shinikizo linaloendelea juu ya usalama wa chakula na vimelea, kazi yetu inatoa taarifa muhimu ambazo zitawezesha ukuzaji wa dawa mpya za wadudu kwa manufaa ya afya ya binadamu na usalama wa chakula duniani. Uchunguzi umeonyesha kuwa dawa za wadudu kama vile AP zinafaa dhidi ya baadhi ya wadudu zinapotumika kulingana na maelekezo ya lebo na zina sumu kidogo kwa wadudu wenye manufaa, na kuonyesha usalama wao wa mazingira.13,16Zaidi ya hayo, majaribio ya baadhi ya viambato vya AP kwenye mbu yameonyesha kwamba hatimaye hupoteza uwezo wao wa kuruka. Kuelewa jinsi misombo hii inayorekebisha inavyofungamana na Nan-Iav kutawezesha marekebisho ya misombo iliyopo au ukuzaji wa misombo mipya kwa ufanisi zaidi nasahihiudhibiti wa wadudu. Utafiti wetu unaonyesha kwamba kiolesura cha Nan-Iav ARD ni muhimu si tu kwa kudhibiti shughuli za misombo asilia, dawa za kuulia wadudu, na Ca2+-CaM, bali pia kwa mkusanyiko wa chaneli. Tunapendekeza kwamba kuvuruga mkusanyiko wa heterodimer kwa kutumia molekuli ndogo kunaweza kuwa mbinu ya kipekee na yenye matumaini ya kutengeneza vizuizi vya chaneli za ioni.
Kati ya jeni nane zenye ortholojia, jeni zenye urefu kamili za mende wa kahawia (Halyomorpha halys) Nanchung na Inactive zilichaguliwa, zikionyesha uthabiti bora katika sabuni. Jeni zilizotengenezwa ziliboreshwa kwa kutumia kodoni kwa ajili ya usemi wa binadamu na kuunganishwa kwenye vekta ya pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) kwa kutumia maeneo ya kizuizi cha XhoI na EcoRI. Hii ilihakikisha kwamba kloni zilikuwa katika fremu na lebo za C-terminal GFP-FLAG-10xHis na mCherry-FLAG-10xHis, ambazo zimekatwakatwa na protease ya HRC-3C (PPX), ikiruhusu kujitegemea.usemiVitangulizi vilivyotumika kunakili Nanchung na Isiyofanya Kazi kwenye vekta ya pBacMam vilikuwa kama ifuatavyo:
Picha za hadubini za chembe za kibinafsi zilipatikana kwenye darubini ya elektroni ya upitishaji ya Titan Krios G2 (FEI) iliyo na kamera ya K3 na kichujio cha nishati cha Gatan BioQuantum. Darubini iliendeshwa kwa 300 keV, ikiwa na mpangilio wa nishati wa 20 eV, saizi ya pikseli ya sampuli ya 1.08 Å/pikseli (ukuzaji wa nominella wa 81,000x), na gradient ya defocus kuanzia -0.8 hadi -2.2 μm. Kurekodi video kulifanywa kwa fremu 40 kwa sekunde kwa kutumia darubini ya Latitude S (Gatan) yenye kiwango cha nominella cha 25 e–px−1 s−1, muda wa mfiduo wa 2.4 s, na jumla ya dozi ya takriban 60 e–Å−2.
Marekebisho ya mwendo unaosababishwa na boriti na uzani wa kipimo yalifanywa kwenye filamu kwa kutumia MotionCor2 katika RELION 4.061. Makadirio ya vigezo vya kitendakazi cha uhamishaji wa tofauti (CTF) yalifanywa katika cryoSPARC kwa kutumia mbinu ya makadirio ya CTF inayotegemea kiraka62. Fotomikrografu zenye azimio la uwekaji wa CTF ≥4 Å zilitengwa kutoka kwa uchanganuzi uliofuata. Kwa kawaida, sehemu ndogo ya fotomikrografu 500–1000 ilitumika kwa uteuzi wa nukta katika cryoSPARC, ikifuatiwa na raundi kadhaa za uainishaji wa 2D baada ya kuchuja ili kupata picha wazi ya marejeleo kwa uteuzi wa chembe zinazotegemea kiolezo. Kisha chembe zilitolewa kwa kutumia visanduku vya mipaka vya pikseli 64 na uwekaji wa visanduku mara 4. Raundi kadhaa za uainishaji wa 2D zilifanywa ili kuondoa kategoria za chembe zisizohitajika. Mfano wa awali wa 3D ulijengwa upya kwa kutumia ujenzi upya wa ab initio na kusafishwa kwa kutumia uboreshaji usio sawa katika cryoSPARC. Uainishaji wa 3D ulifanywa katika cryoSPARC au RELION kulingana na tofauti za ARD. Hakuna tofauti kubwa ya vikoa vya utando iliyoonekana. Chembe zilisafishwa kwa kutumia mbinu za C1 na C2; chembe zenye azimio la juu la C2 zilichukuliwa kuwa za ulinganifu kuhusiana na C2 na kuingizwa katika RELION kwa ajili ya uboreshaji wa Bayesian. Kisha chembe zilihamishiwa tena kwenye cryoSPARC kwa ajili ya uboreshaji wa mwisho usio sawa na wa ndani. Azimio la mwisho na hesabu za chembe zinaonyeshwa katika Jedwali 1.
Wakati wa kusindika pentameri za Nan+AP, tulichunguza mbinu mbalimbali za kuboresha utatuzi wa vikoa vya utando (hasa eneo la vinyweleo), kama vile kutoa mawimbi na ufunikaji wa TMD. Hata hivyo, majaribio haya hayakufanikiwa kutokana na tatizo kubwa katika eneo la vinyweleo na utofauti wa jumla wa TMD. Azimio la mwisho lilihesabiwa kwa kutumia barakoa inayozalishwa kiotomatiki na mbinu isiyo sawa ya usindikaji katika cryoSPARC, ikilenga hasa eneo la ARD. Hii ilipata utatuzi wa juu zaidi kuliko ule wa vikoa vya utando (hasa eneo la VSLD).
Mifano ya awali ya aina mpya za apo za mende za Nanchung na Inactive ilizalishwa kwa mara ya kwanza kwa kutumia Coot63, na mifano ya mende za Nan na Iav ilizalishwa kwa kutumia AlphaFold264 ili kutambua maeneo yenye kujiamini kidogo. Uundaji wa Calmodulin ulitegemea ulinganifu wa mwili mgumu wa modeli zinazofunga Ca2+ na zisizo na Ca2+ katika nyongeza za PDB 4JPZ56 na 1CFD65, mtawalia. Mifano hiyo ilisafishwa kwa kutumia uboreshaji wa duara ili kuhakikisha stereokemia sahihi na jiometri nzuri. Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, na phosphatidylserine kisha zilitengenezwa kama msongamano wa lipidi uliofafanuliwa vizuri, na ligandi za NAM na AP ziliwekwa katika msongamano unaolingana katika makutano yaliyobana. Faili za vikwazo zilitengenezwa kutoka kwa kamba ya SMILES ya isoforms kwa kutumia eLBOW katika PHENIX66. Hatimaye, mifano hiyo ilisafishwa katika nafasi halisi katika PHENIX kwa kutumia utafutaji wa gridi ya ndani na upunguzaji wa kimataifa kwa vikwazo vya muundo wa sekondari. Seva ya MolProbity ilitumika kwa ajili ya uboreshaji wa modeli na uchambuzi wa kimuundo, na vielelezo vilifanywa kwa kutumia PyMOL na UCSF Chimera X. 67,68,69 Uchambuzi wa kitundu ulifanywa kwa kutumia seva ya HOLE,70 na uchoraji ramani wa uhifadhi wa mfuatano ulifanywa kwa kutumia seva ya Consurf.71
Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia Igor Pro 6.2, Excel Office 365, na GraphPad Prism 7.0. Data zote za kiasi zinawasilishwa kama hitilafu ya wastani ± ya kawaida (SEM). Jaribio la t la mwanafunzi (lenye mikia miwili, lisilooanishwa) lilitumika kulinganisha vikundi viwili. Uchambuzi wa tofauti wa njia moja (ANOVA) ukifuatiwa na jaribio la baada ya hoc la Dunnett ulitumika kulinganisha vikundi vingi. *P< 0.05, **P< 0.01, na ***P<0.001 zilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu kulingana na usambazaji wa data. Thamani za Kd, Ki, na vipindi vyao vya kujiamini vya 95% visivyo na ulinganifu vilihesabiwa kwa kutumia GraphPad Prism 10.
Kwa maelezo zaidi kuhusu mbinu ya utafiti, tafadhali tazama Muhtasari wa Ripoti ya Jalada la Asili iliyounganishwa katika makala haya.
Mfano wa awali ulijengwa kwa kutumia mifumo ya calmodulin kutoka kwenye hifadhidata za PDB 4JPZ na 1CFD. Viwianishi vimehifadhiwa katika Benki ya Data ya Protini (PDB) chini ya nambari za kujiunga 9NVN (Nan-Iav-CaM bila ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM iliyofungwa kwenye nikotinamidi), 9NVP (Nan-Iav-CaM iliyofungwa kwenye nikotinamidi na EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM iliyofungwa kwenye aphenidolpyrrolline na kalsiamu), 9NVR (Nan-Iav-CaM iliyofungwa kwenye aphenidolpyrrolline na EDTA), na 9NVS (Nan pentamer iliyofungwa kwenye aphenidolpyrrolline). Picha zinazolingana za hadubini ya cryo-elektroni huwekwa kwenye Hifadhidata ya Electron Hadubini (EMDB) chini ya nambari zifuatazo za upatanishi: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bila ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM tata yenye nikotinamidi), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM tata yenye nikotinamidi na EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM tata yenye aphidopyrrolline na kalsiamu), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM tata yenye aphidopyrrolline na EDTA), na EMD-49849 (Nan pentamer tata yenye aphidopyrrolline). Data ghafi ya uchambuzi wa utendaji imewasilishwa katika karatasi hii.
Muda wa chapisho: Januari-28-2026